大连【指南速览】肠道EB病毒感染组织检测和病理

肠道EB病毒感染时，病毒在黏膜组织中分布不均，溃疡处病毒负荷显著高于非溃疡黏膜，为确定有无EB病毒感染，内镜活检取材部位应重点位于溃疡处。但是初诊患者或诊断不明的患者，为明确诊断，内镜活检应为系统性活检，上消化道活检部位应包括食管、胃体、胃窦和十二指肠，下消化道活检部位应包括回肠末端、盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠和直肠，取材应取溃疡旁黏膜组织，避免只在溃疡底部取材。

EB病毒感染检测方法包括原位杂交、PCR和免疫组织化学技术。原位杂交检测EB病毒编码的小RNA(Epstein-Barr virus-encoded RNA, EBER)在EB病毒潜伏期和病毒复制期均大量存在于感染细胞的细胞核内，EBER原位杂交可在组织切片确定EB病毒感染细胞及其在组织中的定位。PCR可定量检测EB病毒DNA，但无法确定感染细胞及其在组织中的定位，常用于检测外周血EB病毒负荷。免疫组织化学法可检测EB病毒表达蛋白质，包括EB病毒核抗原和潜伏膜蛋白，这些蛋白质分别在病毒感染的不同时期表达。免疫组织化学法仅能检测病毒蛋白质表达阶段，对于细胞内EB病毒低拷贝的检测灵敏性差。上述方法中EBER原位杂交具有高度灵敏性和特异性，组织定位明确，是检测EB病毒感染的金标准。本共识推荐肠道EB病毒感染检测统一采用EBER原位杂交。

目前常用的EBER原位杂交试剂分别有适用于手工和全自动免疫组织化学染色仪两种类型的试剂盒，在规范操作规程下，手工操作和全自动免疫组织化学染色仪操作可达到类似的染色效果。

常用的显色方法包括DAB显色和氯化硝基四氮唑/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸二钠盐(nitro-blue-tetrazolium chloride/5-bromo-4-chloro-3-indonyl phosphate，NBT-BCIP)显色。DAB显色阳性信号着色为棕褐色，苏木精复染细胞核呈蓝色。NBT-BCIP显色阳性信号着色为深蓝色，核固红复染细胞核呈淡红色。DAB和NBT-BCIP两种显色方法相比较，DAB显色方法更清晰、稳定，苏木精衬染对细胞结构的显示清晰，DAB-苏木精组合更符合病理医师阅片习惯。NBT-BCIP在组织中阳性信号不易受背景干扰，识别特异性高，但阳性信号不稳定，易被洗脱导致信号丢失。DAB和NBT-BCIP两种显色方法各有优势，只要阳性信号定位清晰、明确，背景非特异着色无或很轻，对判断阳性信号无影响，均可采用。

送检组织标本应用10%中性甲醛溶液及时固定，最佳固定时间为8～12 h。采用新鲜蜡块，尽量不使用2年以上的蜡块。待测组织切片后应尽快进行原位杂交检测，室温中放置的切片需在1周内完成检测。

每例原位杂交检测都应设置阳性对照、标本质量对照和空白对照。阳性对照：以鼻咽癌组织切片进行原位杂交检测。标本质量对照：一般采用针对U6细胞核小RNA的Oligo探针，对待检组织切片进行原位杂交检测，出现所有细胞核阳性，则证明待测组织标本RNA保存良好，适合进行原位杂交检测。空白对照：以PBS代替探针，对待检组织切片进行原位杂交检测。在各种因素影响下无法常规实现以上3种对照时，本共识建议至少设立阳性对照与空白对照。

判读时首先应确定阳性对照是否定位正确，清晰易辨，Oligo探针对照(即标本质量对照)弥漫阳性(图1A)，空白对照无细胞着色(图1B)。对照组织切片染色结果理想，才可对待检组织切片进行判读。当对照组织切片染色不理想时，待检组织切片的结果不可靠，应仔细查找原因，并重新检测。

注：EBER为EB病毒编码的小RNA；NBT-BCIP为氯化硝基四氮唑/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸二钠盐

▲图1 原位杂交法检测EBER  NBT-BCIP显色  低倍放大A   Oligo探针(针对U6细胞核小RNA)对照弥漫阳性，证明待测组织标本RNA保存良好，适合进行原位杂交检测  B　EBER原位杂交空白对照，无细胞着色

EBER阳性信号定位于淋巴细胞或上皮细胞核，DAB染色呈棕褐色。可靠的阳性信号定位准确，染色强，边缘清晰，背景无非特异性着色(图2)。观察时必须特别注意着色的定位和强度，细胞质出现棕黄色染色，多出现于浆细胞或嗜酸性粒细胞等炎症细胞，属于非特异性着色，不应判读为阳性信号(图3)。

注：EBER为EB病毒编码的小RNA；DAB为二氨基联苯胺

▲图2　原位杂交法检测EBER显示淋巴细胞阳性，阳性信号定位于细胞核，染色强，边缘清晰，背景无非特异性着色　DAB-苏木精显色高倍放大

注：EBER为EB病毒编码的小RNA；DAB为二氨基联苯胺

▲图3　EBER原位杂交非特异性着色，浆细胞胞质出现棕黄色，不能判读为阳性信号　DAB-苏木精显色　高倍放大

①选择阳性细胞最密集处，计数1个高倍视野(400倍)下阳性细胞数作为EBER阳性细胞计数。②在阳性细胞密集处，数10个高倍视野(400倍)下阳性细胞数，取其平均值作为EBER阳性细胞计数。方法①计数方便快捷，方法②计数能较客观地反映组织中EBER阳性细胞数，但是实际操作比较繁琐耗时，适用于科学研究。在阳性细胞分布不均的病例中，两种方法计数结果可能有较大差别。各单位采用统一的计数方法，其结果才具有可比性。本共识建议在实际工作中，统一采用方法①进行计数，并在病理报告中说明采用的计数方法。

结肠黏膜EBER阳性细胞一般为淋巴细胞。结肠黏膜活检组织中EBER阳性可见于炎症性病变和肿瘤性病变，极少见于正常结肠黏膜组织。EBER阳性的炎症性病变多见于IBD患者合并EB病毒感染，肿瘤性病变则为EB病毒相关淋巴组织增殖性病变/淋巴瘤。

该病变多见于IBD，尤其是UC，由于肠道局部炎症刺激和免疫抑制剂的应用，引起潜伏EB病毒的再激活。EBER阳性的意义不能孤立地以EBER阳性细胞数进行界定，需要综合临床表现、内镜特征、组织学特征，并参考外周血EB病毒DNA拷贝数进行综合分析。本共识建议将EBER的阳性表达分为高表达、低表达和无临床意义的非致病性潜伏感染3种类型。①EBER高表达：对于组织中有临床意义的EBER阳性细胞数，目前尚鲜见文献提出明确的阳性界值，本共识建议暂定每高倍视野EBER阳性细胞数≥10作为EBER高表达的标准，需考虑EB病毒性肠炎。由于单纯EB病毒性肠炎少见，该类情况多见于IBD合并EB病毒性肠炎(机会性感染)，其中UC合并EB病毒性肠炎多于CD合并EB病毒性肠炎。由于免疫抑制剂和生物制剂的使用，使局部免疫监视下降，潜伏的EB病毒再激活，导致比IBD基础改变更严重的黏膜损伤，包括内镜下表现的溃疡与活动性指标升高，临床表现为难治性IBD，多伴外周血EB病毒DNA拷贝数不同程度升高。组织学上常表现为溃疡，多量淋巴细胞、浆细胞浸润，细胞一般无异型性(图4)。②EBER低表达：每高倍视野EBER阳性细胞数<10，临床意义难以单独依靠EBER阳性细胞数确定，需要结合临床综合分析。若表现为IBD不能解释的活动性病变，或难治性IBD，则倾向IBD合并EB病毒性肠炎。若临床和内镜下均为无明显异常表现，则倾向非致病性潜伏感染。③EBER非致病性潜伏感染：EBER阳性细胞数为1～2个/高倍视野，全片仅个别阳性细胞，多属于无临床意义的EB病毒非致病性潜伏感染。在炎症等因素刺激下，局部出现EB病毒非特征性扩增，外周血EB病毒DNA拷贝数无增高。组织学表现为黏膜固有层淋巴细胞、浆细胞数量正常或仅有轻度增多，细胞无异型性(图5)。

注：UC为溃疡性结肠炎；EBER为EB病毒编码的小RNA；DAB为二氨基联苯胺

▲图4　UC合并EB病毒性肠炎的病理特征　A　黏膜固有层大量淋巴细胞、浆细胞浸润　苏木精-伊红染色　高倍放大　B　EBER高表达，每高倍视野阳性细胞数>10　DAB-苏木精显色　高倍放大

注：UC为溃疡性结肠炎；EBER为EB病毒编码的小RNA；DAB为二氨基联苯胺

▲图5　UC伴EB病毒非致病性潜伏感染的病理特征　A　黏膜固有层　淋巴细胞、浆细胞浸润　苏木精-伊红染色　高倍放大　B　EBER低表达，每高倍视野阳性细胞数为1　DAB-苏木精显色　高倍放大

该病的组织学表现以淋巴组织增生为特征，伴不同程度黏膜结构破坏，淋巴细胞具有不同程度异型性，每高倍视野EBER阳性细胞数常>50，包括EB病毒阳性淋巴瘤、慢性活动性EB病毒感染累及消化道，以及医源性免疫缺陷相关淋巴组织增殖性疾病，后两种病变较少见。①EB病毒阳性淋巴瘤，以结肠结外鼻型NK/T细胞性淋巴瘤最常见，多发生于结肠，临床表现为肠腔肿物或溃疡，组织结构破坏，异型淋巴样细胞弥漫浸润(图6)。②慢性活动性EB病毒感染累及消化道则多见于儿童，表现为发热、淋巴结肿大、肝脾大等系统性症状，病程>3个月，外周血EB病毒DNA拷贝数升高。组织学表现为淋巴组织增生，伴不同程度黏膜结构破坏和细胞异型性(图7)。需要指出的是，关于局限于肠道的慢性活动性EB病毒感染，目前相关文献资料有限，诊断标准尚缺乏共识。从专家讨论过程中所反映的个人经验来看，慢性活动性EB病毒感染累及消化道发生于成年患者时，与EB病毒性肠炎或IBD合并EB病毒性肠炎的鉴别非常困难，需要完整、充分的临床病理资料综合分析。③医源性免疫缺陷相关淋巴组织增殖性疾病发生于长期使用免疫抑制剂的IBD患者，组织学类型包括EB病毒阳性黏膜皮肤溃疡、弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、非特殊性外周T细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤等。

注：EBER为EB病毒编码的小RNA；DAB为二氨基联苯胺

▲图6　结肠结外鼻型自然杀伤细胞/T细胞性淋巴瘤的病理特征　A　结肠黏膜结构破坏　苏木精-伊红染色　低倍放大　B　异型淋巴样细胞浸润　苏木精-伊红染色　高倍放大　C　可见大量EBER阳性细胞　DAB-苏木精显色　中倍放大

注：EBER为EB病毒编码的小RNA；DAB为二氨基联苯胺

▲图7　慢性活动性EB病毒感染累及结肠　A　黏膜隐窝结构大致正常，固有层淋巴细胞浸润，细胞异型性不明显　苏木精-伊红染色　中倍放大　B　可见大量EBER阳性细胞　DAB-苏木精显色　中倍放大

EBER原位杂交检测是确定肠道EB病毒感染的金标准。EBER原位杂交的质量控制至关重要，严格控制组织处理、设立对照和正确判断染色结果是诊断肠道EB病毒感染的关键环节。肠道EB病毒感染多见于IBD和EB病毒阳性淋巴组织增殖性病变/淋巴瘤，对于EBER在IBD中的表达及其临床意义的认识尚处于初步阶段，有待更深入的临床病理研究，以明确探讨EB病毒对IBD病程发展的作用及其对IBD患者预后的影响。目前，EB病毒性肠炎和局限于肠道的慢性活动性EB病毒感染诊断标准均未明确，需要深入的临床病理研究，确定二者的诊断和鉴别诊断标准。

志谢　中华医学会消化病学分会主任委员陈旻湖教授和中山大学附属第六医院首席专家胡品津教授首先对病理医师提出系统讨论该文所涉及问题的要求并提供实际指导和宝贵建议。于2018年10月28日在武汉大学病理与分子诊断中心组织专家们共同现场阅片及讨论。参加共同阅片的非协作组成员医师还包括浙江大学附属邵逸夫医院姜支农主任，武汉大学病理与分子诊断中心陈琼荣副主任医师、樊利芳副教授、陈琰琰住院医师，北京大学深圳医院陈翠敏主治医师，中山大学附属第六医院娄晓盈住院医师，特此感谢

来源：中华医学网