大连周丽雅教授｜胃干细胞研究现状与进展

干细胞是一类具有自我更新能力、高度增殖能力和多种分化潜能的细胞，根据其来源不同可分为胚胎干细胞和成体干细胞。其中，成体干细胞是指存在于人体组织中具有自我更新和多向分化潜能的细胞，其对于组织更新与损伤修复至关重要。胃干细胞即为存在于胃组织中的成体干细胞，在维持胃黏膜上皮动态更新中发挥关键作。随着研究的不断深入和研究技术的革新，对胃干细胞分子标志物及细胞调控的探索取得了较大进展，体外胃干细胞研究模型的建立为进一步揭示胃干细胞在胃部生理及病理状态下的意义提供了条件。基于实体肿瘤可能是干细胞疾病的理论，已有研究阐明胃癌的发生亦与胃干细胞关系密切，这为胃癌的防治提供了新的方向和契机。本研究立足于胃干细胞的生理特点、体外研究模型及其在胃部疾病( H.pylori 感染和胃癌)中作用等角度，对胃干细胞的研究现状与进展作一综述。

胃小凹及其相连的3～5个胃腺体构成的胃单元(gastric unit)是胃黏膜的基本结构单位，胃腺体由浅入深可分为峡部、颈部和底部，峡部开口于胃小凹。在生理状态下，胃黏膜处于持续动态更新中，胃腺体峡部和颈部的细胞处于活跃增殖的状态，该区域被视为胃干细胞所在的位置，但在早年的研究中并未得到直接的证据。随着细胞谱系分化示踪技术的出现和发展，大量的研究已证实胃腺体的颈部-峡部区域及不同解剖部位的胃腺体基底部为胃干细胞所在的位置，其周围的细胞和细胞外基质成分则形成了干细胞池特定的微环境[]。在微环境中生长因子作用下，不同部位的胃干细胞可向颈黏液细胞、主细胞、壁细胞和内分泌细胞等定向分化，最终形成成熟的胃黏膜上皮。在正常的生理状态下，这一动态更新过程约2～7 d发生一次；而在损伤、感染等情况下，随着上皮更新加速，胃干细胞分化进程也显著加快。

目前已发现的胃干细胞的常见分子标志物有富含亮氨酸重复序列的G蛋白耦联受体5(leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5，Lgr5)，三叶因子家族2(trefoil factor family 2，TFF2)，性别决定域Y框蛋白2 (sex determining region Y box protein 2，SOX2)，胆囊收缩素B型受体(cholecystokinin type-B receptor，CCK2R)，肌肉、小肠和胃表达因子1(muscle, intestine and stomach expression 1，Mist1)，多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domain 1，Lrig1)，绒毛蛋白(Villin)启动子，以及由肿瘤坏死因子受体超家族成员19(tumor necrosis factor receptor superfamily 19, TNFRSF19)编码的蛋白质Troy等(表1)。Barker等通过体内谱系示踪实验证实，胃窦幽门腺体底部Lgr5阳性表达的细胞为具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，其可作为胃干细胞的识别标志物。TFF2多由位于胃底腺峡部的干细胞表达，可分化形成上皮祖细胞，后双向分化形成颈黏液细胞、壁细胞和主细胞。Arnold等应用Sox2^-CreER；ROSA26^-lsl^-EYFP转基因小鼠模型进行谱系示踪发现在胃幽门区的腺体中存在一小部分SOX2阳性的细胞，这些细胞具有自我更新和产生成熟的胃腺细胞的能力。随着研究的深入，胃窦部CCK2R标记阳性的细胞也被证实是胃干细胞，其可对促胃液素发生应答，该类细胞与胃窦部腺体底部Lgr5⁺的胃干细胞并不相同。Mist1作为胃肠道外分泌细胞中分泌颗粒形成和成熟的必需因子，相关研究亦证实其可作为胃体腺峡部静止期干细胞的表面标志物。Lrig1可作为胃体祖细胞的分子标志物，阳性细胞最终可定向分化形成胃体细胞。Villin启动子标记阳性的胃祖细胞主要位于幽门腺峡部下1/3的部分腺体，在胃体腺几乎无此类干细胞，谱系示踪显示该类细胞可向黏液腺细胞、内分泌细胞和壁细胞分化，并且可参与γ-干扰素诱导的炎症应答，此类细胞的表型转化与胃黏膜肠化生无关。胃体部Troy⁺的部分主细胞亦被认为是胃体干细胞的标志分子，可分化形成所有胃上皮细胞类型并参与毒素所致的黏膜损伤修复。上述研究亦表明不同解剖部位的胃黏膜腺体干细胞在其起源、增殖、分化和表达谱上存在差异。

表1 胃干细胞/祖细胞分子标志物、细胞定位及分化方向

胃干细胞的增殖、生长和分化的调控与干细胞池内特定微环境密切相关，这一微环境主要由一组细胞和胞外基质组成。其中，肠上皮下成纤维肌细胞在促进胃干细胞向其成熟的子细胞分化的启动环节中发挥关键作用，肠上皮下成纤维肌细胞分泌产生的肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、TGF-β等生长因子与干细胞表面的受体结合，从而启动分化。另外，Wnt/β-联蛋白(β-catenin)、Notch、Hedgehog等信号通路在胃干细胞的自我更新、增殖和凋亡的调控中也发挥了重要作用，任何一个信号通路的调控发生异常都有可能诱发其恶性转化。例如，Oshima等在K19^-Wnt1转基因模型小鼠中证实Wnt信号通路对于维持胃体峡部区域祖细胞的未分化状态至关重要，该信号的异常持续激活可使祖细胞数目显著增多。也有研究指出Notch可直接调控Lgr5⁺胃干细胞，其异常激活可促使胃干细胞向胃癌干细胞转化而导致胃癌发生。

2007年，Yang等首次通过一种新的体外细胞培养方法从健康的人胃组织里培养出胃上皮细胞克隆，这些细胞克隆具有近似胃干细胞的特性，包括快速增殖、多向分化、八聚体结合转录因子4(octamer transcription factor 4, Oct-4)阳性表达等。随后，Barker等将Lgr5^-EGFP^-ires^-CreERT2小鼠胃腺体内分离出的单个Lgr5⁺ve细胞培养在含有EGF、Noggin、R-sponding的三维基质胶(matrigel)培养体系中，发现在该培养体系下Lgr5⁺ve细胞能够形成类似于胃的微型结构，即胃类器官(gastric organoid)。该液体环境模拟体内干细胞所处的微环境，R-spondin(Wnt信号通路激活剂)和EGF是维持Lgr5⁺胃干细胞体外增殖的重要因素，Noggin可促使类器官中胃小凹数目增多，富含层黏连蛋白的基质胶提供支持胃类器官生长的环境。这一胃类器官模型在体外可以进行长期增殖并保持稳定的遗传特性和生物学行为，同时因其包含了能够产生多种细胞亚型的祖细胞群，其在体外培养诱导条件下能够分化形成具有不同功能的胃上皮细胞。2017年，Garcia等使用富含EGF、HGF、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)等的培养基对成人胃黏膜层细胞进行原代分离培养，观察到在呈单层生长的胃成纤维细胞表面可见球状克隆形成，对成球状生长的细胞团进一步鉴定发现这些细胞可表达胚胎干细胞和胃干细胞特有的分子标志物，并能在体外培养条件下自发分化形成胃上皮祖细胞。上述体外胃干细胞模型的成功建立，尤其是胃类器官模型的建立，为进一步深入探究胃干细胞在生理和病理条件下的作用机制奠定了基础。

H．pylori 长期持续感染是致胃癌发生的关键诱因之一，基本机制包括长期感染后胃黏膜慢性炎症刺激、肿瘤抑癌基因的遗传学和表观遗传学的改变、致癌信号通路的激活等。除上述作用机制外，近来相关研究表明 H.pylori 感染亦能诱发胃干细胞静息-增殖分化失衡，促使胃干细胞表型转化而参与其致癌过程。既往研究认为 H.pylori 主要定植于胃黏膜表面的细胞，通过细菌所具有的Ⅳ型分泌系统将致病因子细胞毒素相关蛋白A(cytotoxin associated gene A, CagA)导入细胞内而致病。近年研究发现，在H.pylori感染后的小鼠及人的胃黏膜标本中，胃腺体的颈部和腺体基底部的胃干细胞池亦可观察到 H.pylori 定植形成的微菌落，说明H.pylori可以直接作用于胃干细胞而参与致病。应用Lgr5^-Egfp^-ires^-cREert2/Rosa26^-TdTomato小鼠感染 H.pylori 模型研究证实，定植于胃干细胞池内的 H.pylori 在胃黏膜尚未出现显著的炎症表现时即可通过直接作用于Lgr5⁺胃干细胞加速其增殖分化，且该促进作用依赖于 H.pylori 的CagA毒力因子。Sigal等研究发现 H.pylori 除直接作用于胃干细胞外，还可促进胃黏膜下方的间质成纤维细胞合成分泌R-spondin增多，R-spondin可激活Wnt信号通路，诱导位于腺体基底部的Axin2⁺/Lgr5^-胃干细胞过度增殖，致使干细胞在增殖过程中累积大量DNA损伤，从而诱发癌症。与 H.pylori 阴性的胃癌患者相比，H.pylori 阳性的胃癌患者胃窦黏膜Lgr5⁺细胞数显著增多，并且Lgr5⁺细胞比Lgr5^-细胞DNA氧化损伤水平更高，提示H.pylori可通过介导胃干细胞的DNA损伤增加胃癌发生风险。H.pylori持续感染还可激活Notch、Hedgehog等信号通路，诱发干细胞池微环境紊乱，促进胃干细胞增殖、分化失衡甚至恶性转化。此外，胃干细胞在 H.pylori 感染引发的持续炎性反应作用下，肠型或胃型上皮相关基因激活导致的表型转化亦参与了 H.pylori 致癌的病理过程。

胃癌的发生是一多步骤、多阶段的过程，其与宿主因素、环境因素等密切相关。根据胃癌的组织学形态和细胞特点将胃癌分为肠型、弥漫型和混合型(即Lauren分型)。肠型胃癌发生的Correa模型认为胃黏膜经历慢性炎症反应、萎缩、肠化生甚至异型增生，最终形成肠型胃癌，该理论已得到广泛的认同。弥漫型胃癌的发生模式不同于肠型胃癌。既往针对弥漫型胃癌的病理组织标本研究发现，家族性早期弥漫型胃癌在结构上呈现"双层结构"：上层的印戒细胞体积较大，黏液丰富，多处于静止状态；而基底层的印戒细胞较原始，体积较小，增殖活跃，并在空间位置上靠近癌旁的胃腺颈部/峡部的增殖区，这一区域恰恰被认为是胃干细胞所在的区域，这从肿瘤发生的空间位置上提示弥漫型胃癌可能起源于胃干细胞。此外，弥漫型胃癌组织内包含了多种不同分化类型的癌细胞，其中大部分癌细胞在分化上与胃小凹上皮相似，部分癌细胞类似于幽门上皮，同时尚有部分癌细胞可表现出神经内分泌细胞的特点。弥漫型胃癌所具有的这一多向性分化特点提示其组织学的发生可能来源于具有多向分化潜能的胃干细胞，但目前尚未有相关研究证实。Tatematsu等发现，胃干细胞在肠上皮分化过程中表现出异常的细胞分化，同一个干细胞可产生胃、肠型细胞，不同组织类型胃癌的表型表达也被相应地分为胃型和肠型细胞。此外，Kirchner等认为，胃癌起源于胃干细胞，这些干细胞从胚胎发育开始保持在未分化状态，或是源于成熟细胞的去分化而使其重新成为具有增生和更新潜能的细胞。

动物体内实验进一步表明胃干细胞确实对胃癌起源具有重要意义。Li等研究表明，Lgr5⁺胃干细胞在Smad4和10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)敲除小鼠的胃窦部可迅速从微腺瘤发展成浸润性腺癌，而胃窦部分化成熟的Lgr5⁺壁细胞、小凹细胞及体部的主细胞并未形成肿瘤，进一步针对肿瘤基因组计划(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库内数据分析的结果亦支持胃窦部和胃食管交界处的肠型腺癌均伴有Lgr5的扩增。虽然胃窦部Lgr5⁺胃干细胞可分化形成胃黏膜上皮的所有细胞类型包括内分泌细胞，但Vetter等通过对CEA424^-SV40^-Tag转基因小鼠的研究发现，幽门部Lgr5⁺胃干细胞并非胃神经内分泌肿瘤的起源细胞。也有研究证实Lgr5⁺细胞并非解痉多肽表达性化生(spasmolytic polypeptide-expressing metaplasia，SPEM)的起源细胞。Sarkar等在Apc缺失的小鼠体内研究发现，SOX2的表达缺失上调Tcf/Lef依赖的转录及肠化生相关基因的表达，最终可导致肿瘤的形成，这提示SOX2除作为胃干细胞的标志物外，还可能作为一种抑癌蛋白，经由Wnt通路在胃肿瘤发生中发挥抑制作用。此外，转录因子Klf-4的表达下调与胃癌发生有关。在Klf-4敲除小鼠体内研究发现，Villin启动子表达阳性的胃窦小弯腺体底部的干细胞增殖加快，并且该区域胃黏膜出现黏膜增生及自发性胃腺瘤的形成，但这部分胃腺瘤即使在化学致癌剂亚硝基甲基脲作用下也不向腺癌进展，提示还存在其他分子机制参与Klf-4表达缺失的Villin启动子阳性干细胞向肿瘤干细胞的转化。另外，胃肠道上皮的更新极为迅速，因此上皮细胞的突变一般不足以引发恶性病变，这提示寿命较长的干细胞更易在外界环境如炎症持续刺激、致癌物刺激等作用下累积突变而发生恶性转化，从而诱发胃癌形成。

胃干细胞在胃黏膜上皮的动态更新和损伤后修复中发挥关键作用。随着谱系追踪和分子标记等技术的发展，人们对于胃干细胞的生理特性的认识取得突破性进展，也确定了Lgr5、SOX2等分子标志物，并建立了体外研究模型。由于胃干细胞增殖、分化的动态平衡是维持干细胞池稳态的关键，持续的炎症反应可诱发干细胞增殖加速而致胃干细胞池失稳态，进而参与胃黏膜病变的发生。H.pylori 感染诱发胃干细胞静息-增殖分化失衡及细胞表型转化可能是其致胃癌的机制之一。同时，胃干细胞也可能作为胃肿瘤的起源细胞而参与了胃癌发生、发展的多个步骤。深入探究胃干细胞在胃黏膜损伤修复中的作用机制及其在胃黏膜发生肠化生和异型增生中的作用至关重要，尤其是如何将胃干细胞与H.pylori的致病机制、胃癌发生的分子机制及起源之间联系起来可能成为今后研究热点。随着干细胞研究技术及理论的发展和深入，胃干细胞的研究在胃部疾病防治方面具有广阔前景。

参考文献（略）

作者：肖士渝 周丽雅   来源：消化科空间