大连“它”的发现，带来炎症性肠病治愈新希望

炎症性肠病（IBD）是一种慢性胃肠道疾病，包括克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）。仅在欧洲和北美就有350万人受该病困扰，同时其在亚洲、非洲和南美洲的发病率也在不断上升。IBD会影响患者的生活质量，尤其是在那些经历腹泻、腹痛、血便、发热、疲劳、食欲减退和体重减轻等严重症状的青少年和年轻人中更严重。IBD具有典型的肠上皮屏障功能受损和渗透性增加症状。肠道在没有有效的屏障保护下，肠腔内容物、病原微生物和共生微生物群会转移到肠道固有层中，导致炎症发生。因此，迫切需要通过治疗恢复肠道屏障，使其能够选择性地透过物质。

肠道屏障通过不同类型的柱状上皮细胞单层维持其完整性，包括小肠或大肠特有的细胞类型。这些上皮细胞共同起作用以形成有效的生物屏障。结构蛋白将这些细胞彼此横向束缚，以维持控制溶质和水运输的物理屏障。在这些蛋白质中，claudins和occludins形成可调节的密封，称为紧密连接，在上皮细胞之间建立细胞屏障。紧密连接通透性的主要调节因子是肌球蛋白轻链激酶（MLCK）。如果MLCK由于突变或表达升高不能正常发挥作用，不仅可以导致肠道疾病状态，还可以导致肺和心脏等其他器官的疾病状态。

紧密连接周围肌动球蛋白环（PAMR）是肌动蛋白和肌球蛋白II的细胞骨架环，环绕于肠上皮细胞并与紧密连接蛋白相关。作为肌球蛋白的小多肽亚基，肌球蛋白轻链（MLC）通过MLCK磷酸化之后收缩该环，在紧密连接蛋白上产生张力，使其细胞间的紧密连接变得松散并增加屏障通透性。TNF-α作为一种高炎症细胞信号蛋白，其表达水平在IBD患者的肠道组织中有所升高，通过MLCK1增加PAMR中MLC的磷酸化，导致紧密连接松散以及食物抗原、大分子和微生物进入无菌固有层中（图1）。

图1 Divertin可以恢复IBD模型中的紧密连接功能

Graham等报道了MLCK的两种异构体MLCK1和MLCK2在肠上皮细胞中的差异性表达模式，其中MLCK2定位于胞质，而MLCK1定位于PAMR。同时，MLCK1在结肠炎模型小鼠的上皮细胞PAMR中也存在，而其在健康小鼠中并不存在。为开发特异性针对MLCK1的治疗药物，Graham等专注于研究只存在于MLCK1而非MLCK2中的单个结构域。同时，为验证MLCK1特有结构域中是否含有药物结合位点，研究者解析了其晶体结构并发现一个可结合的疏水区域。Graham等假设可结合的小分子可能抑制MLCK1向PAMR的转运。他们筛选了一个大约含有140000个分子的文库，并将搜索范围缩小到一个可降低紧密连接通透性的化合物。该化合物的一个特性是它不会抑制与毒性相关的其他MLCK抑制剂靶向的MLCK1激酶活性，因此，不会影响上皮伤口愈合或肠道运动所需的平滑肌收缩。

该化合物作用于人类结肠上皮细胞系，抑制MLCK1向PAMR的转运（图1）。它可以逆转TNF诱导的、MLCK1介导的MLC磷酸化，有效恢复TNF处理后损伤的细胞屏障功能。因为该化合物抑制MLCK1向PAMR的转移，所以将其命名为Divertin。Divertin的作用模式是防止激酶募集到其底物上，而不是传统的药物诱导的酶活性阻断或底物结合阻断，是精确亚细胞靶向的新型治疗策略。MLCK1的运输涉及到一种未鉴定的蛋白质，其充当MLCK1和MLC之间的媒介。对于目前有限的治疗方式来说，这种蛋白（如果存在的话）可以作为一个额外的治疗靶标，进而有效恢复屏障通透性。

进一步研究表明，MLCK1中的药物结合位点在人和小鼠中是相同的，因此可以在小鼠中进行临床前功效测试。

使用TNF-α诱导的炎症小鼠模型，Graham等用Divertin以模拟口服给药的方式处理小鼠，发现其可以抑制屏障丧失、阻断TNF诱导的肠道MLC磷酸化并抑制腹泻。尤其是，Divertin不影响上皮细胞更新，并且在未注射TNF-α的小鼠中无毒性。在人空肠活检中，Divertin在抑制MLCK1募集到PAMR和MLC磷酸化方面具有相似的效果，这些空肠活检样本是从健康人群获得并在用TNF-α刺激培养的。在这些组织中，Divertin还阻断了紧密连接蛋白occludin的内吞作用，该蛋白是屏障功能障碍的指标。

在IBD的两个小鼠模型中，在症状发作之前每日注射Divertin以保持肠屏障功能，防止小鼠体重减轻并降低其死亡率。其中一种模型，用特异性抗TNF抗体中和TNF-α的疗效（这是IBD患者常用的治疗策略），以比较Divertin与抗TNF治疗的疗效。惊喜的是，Divertin在增加处理小鼠存活率，减少粪便含水量、免疫细胞浸润和结肠组织病理学方面表现优于TNF-α治疗，所有这些都在IBD患者中观察到。同时，Divertin在降低肠道组织内广泛的炎症细胞因子水平方面也比抗TNF-α更有效。单独使用Divertin足以减轻疾病严重度并阻止疾病进展，但只有Divertin和抗TNF的联合使用才能导致小鼠100%存活，并阻止疾病活动的进展。

需要进行临床试验测试Divertin对IBD患者的疗效，特别是那些对抗TNF治疗无效或用抗TNF初始治疗后转变为难治性IBD的患者。Graham等发现，Divertin似乎不会影响TNF受体信号通路，表明在用抗TNF治疗的个体中，Divertin可能对抗TNF治疗相关的免疫抑制无效。这种免疫抑制是由于TNF受体信号通路干扰造成的，并导致对感染、恶性肿瘤和其他不良反应的易感性增加。IBD的替代治疗试图从疾病发病的不同方面去阻断，例如抗整合素制剂可以阻断炎性免疫细胞募集，但却不具有免疫抑制功能。

具有独特作用机制的Divertin将是IBD疗法的重要补充，可以特异性地改变肠道通透性。Divertin也可作为克罗恩病患者一级健康亲属的重要预防措施。高达40%的患者亲属表现出小肠通透性改变以及患克罗恩病的风险增加。此外，尽管没有症状，生化指标也正常，但对那些因为小肠通透性受损导致再发风险高的克罗恩病患者来说，Divertin治疗可能有益。Divertin在恢复肠上皮屏障功能方面的功效应该为验证其对内皮屏障功能的活性奠定基础，特别是对于那些在多发性硬化症中受损的血脑屏障。

参考文献

W. Vallen Graham, Weiqi He,et,al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nat Med. 2019 Apr;25(4):690-700.

文章缩译自：

Blander JM. A new approach for inflammatory bowel disease therapy. Nat Med. 2019;25(4):545-546.