大连Gut：英国研究者成功开发首个预测IBD患者预

在之前的报道中，通过对患有活动性、未治疗自身免疫性疾病的患者，进行CD8⁺ T细胞基因表达数据的无假设检测，鉴定出成千上万个基因，其差异表达可以定义两个不同的患者亚群。而这两个亚群，通过使用同一批患者来源的未分离外周血单核细胞（PBMCs）是无法进行区分的。在包括克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）的所有疾病研究中，将患者纳入队列时无法鉴别其亚型，然而他们会在后续研究过程中经历不同的疾病进程，包括首次复发时间以及所需升级治疗的次数方面都会有差异。最近的研究认为，T细胞耗竭在IBD患者间存在差异。最早的报道认为T细胞耗竭是慢性病毒感染的结果，但是现在认为其发生与持续性的自身抗原相关。由于其对疾病相关抗原的持续反应力减弱，因而发生T细胞耗竭的患者的预后更好，疾病复发时间延缓、发作减少。

研究招募未经治疗的活动性IBD患者。对纯化的CD8⁺ T细胞和（或）全血进行转录组学分析，收集表型数据。按照CD8⁺ T细胞转录组的一致性聚类来鉴别IBD1 / IBD2患者亚群。在实验队列中，机器学习（machine learning）用于识别分类基因（“分类器”），这些基因在全血中的差异表达可以用于对IBD1 / IBD2亚群的重新分类。通过定量PCR优化获得最佳分类基因，而进一步机器学习可以签定出经定量PCR优化的分类基因，优化的分类基因被锁定用于进一步的检测。之后，分别在CD（n = 66）和UC（n = 57）单独队列中进行独立验证。

研究者既往曾报道过，基于IBD1/IBD2亚型的预后生物学标志物，可作为一种有用的临床工具。但是，对于那些需要纯化CD8+ T细胞或微阵列分析的检测方法，将其转化到临床实践非常困难。因此，研究者考虑，是否可以通过全血，而不需要细胞分离，去鉴定患者亚型。研究者进行了一个包含69例患者（39例CD、30例UC；35例IBD1、34例IBD2）的队列研究， 并获得了他们的CD8⁺T细胞转录组学数据和全血PAXgene血液RNA样本数据。他们从PAXgene 血液RNA管中提取RNA，并通过微阵列检测全基因组基因表达。对原始数据进行预处理，以创建可用于分类器开发的标准化数据集（材料和方法），并通过机器学习鉴别基因组（“分类器”）。最终，鉴定出一系列潜在模型，其中，包含12个基因的最佳模型可准确鉴定IBD1/IBD2亚型（P=1.6×10^-7）。

为了将以上结果转化为临床可用的工具，研究者检查了最初模型并选出39个候选基因和3个参考基因，用于qPCR优化（图1A）。在候选基因中，12个基因是最佳的微阵列分类器成员，6个基因与最佳分类器中的基因高度相关，21个基因根据机器算法筛选。与微阵列数据相关性差的基因被排除（n=6）。通过qPCR数据，我们筛选出最佳分类器，包含17个基因，及15个有效基因和2个参考基因，被用于进一步测试。

图1 基于全血qPCR分类器开发、优化和验证工作流程示意图

开发任何新型生物学标志物的关键步骤是进行独立验证。研究者在CD和UC患者验证队列中测试了qPCR分类器。当其被用于这些独立样本时，分类算法会将每位患者分类为“IBDhi”（类似于IBD1）或“IBDlo”（类似于IBD2）亚群。在CD和UC验证队列中，IBDhi和IBDlo亚群的患者经历了非常不同的疾病进程。相比于IBDlo患者，IBDhi患者具有更加持续性、进展性的疾病，需要进行更早及更频繁的升级治疗（使用免疫调节剂、生物制剂或手术）。CD队列中首次升级治疗时间差异HR为2.65（95%CI：1.32~5.34；P=0.006），而UC队列中HR为3.12（95%CI：1.25~7.72；P=0.015）。此外，无论基础疾病如何，IBDhi患者都会经历需要更有效的治疗来实现缓解的疾病进程。在前18个月内，预测CD患者需要多次升级治疗的敏感性和特异性分别为72.7%和73.2%，在UC中分别为1005和48%。在UC中的低特异性，反映出观察到的治疗升级率较低（UC队列中有36次升级治疗，而CD中有67次）。尽管所有需要多次升级治疗的UC患者均为IBDhi类型，但并不意味着所有IBDhi患者在18个月内都需要升级治疗。由于这个检测可用于临床诊断，阴性预测（即正确识别的患者不需要进行额外治疗）显得更为重要，这样既可以改善资源分配，又不会错过使进展性疾病患者错过最佳治疗的“窗口”。在这些验证队列中，预测前18个月内需要进行升级治疗的阴性预测值很高：CD为90.9%，UC为100%（图2）。

为了便于将该检测技术转化为临床检验工具，研究者还进行了分析验证，以评估每个基因qPCR测定及组合多分析物衍生风险评分的精确度、检测限、线性、输入RNA范围以及冷冻/解冻循环。还评估了特定来源（例如操作者和批次）对总测定方差的影响。总之，这些分析和临床验证数据使得CE标记的测定，已准备好用于临床。

图2  在独立队列中验证q-PCR分类器

招募了66例CD患者，其中51例（77.3%）患者是在入组时新诊断的，IBD1患者33例，IBD2患者33例。与IBD2相比，IBD1亚群患者需要治疗升级的时间明显缩短（图3A）。有趣的是，临床参数（需要使用激素治疗、年龄＜40岁和肛周疾病中任选两项）和严重的内镜特征（包括至少一个结肠段的深度和广泛溃疡）都无法预测是否需要早期升级治疗（图3B，图3C）。即使研究者尝试将这些或其他临床特征结合到预测分类器中，发现它们都没有能够改善分类器的表现。

由于持续复发或慢性活动性疾病，患有CD的IBD1患者需要更多的治疗升级（图3D，E）。实际上，在IBD1中，要求升级到生物治疗的相对风险（RR）为3.0（12/33 IBD1患者，4/33 IBD2患者）。同样，IBD1中不需要任何药物治疗的RR为0.53（8/33 IBD1患者，15/33 IBD2患者）（图3E）。各组之间的总手术率无显著差异（10/33 IBD1，7 / 33 IBD2）。值得注意的是，所有需要进行全胃切除术的患者都在IBD1亚群中。

图3  CD患者中IBD1和IBD2 的疾病进程不同

共招募52例UC患者，其中35例（67.3%）为新诊断。24例患者为IBD1，28例患者为IBD2。与CD队列一样，IBD1亚群的UC患者的疾病进展性更快，需要更早的治疗升级。而基线内镜严重度并不能预测治疗升级的需要。随着时间的推移，由于疾病的反复发作，IBD1患者需要更多的升级治疗。此外，UC和CD队列之间还存在几个相似之处，IBD1 UC患者中不需要任何治疗升级的概率，约为IBD2 UC患者的一半（RR=0.45），而需要升级为生物治疗或结肠切除术的RR为4.08（7/24 IBD1患者，2/28 IBD2患者）。事实上，在所有患者队列中，只有IBD1 / IBDhi患者需要行结肠切除术（7/56 IBD1或IBDhi患者；0/48 IBD2或IBDlo患者，P=0.01）。

文章来源：Biasci D, Lee JC, Noor NM, et al. A blood-based prognostic biomarker in IBD. Gut. 2019;68(8):1386-1395.