肥胖者饮酒肝脏损伤更重？
摘要
酒精性肝病(ALD)的发病率呈逐年增高趋势，每年因过量饮酒引起的个体健康危害、公共安全危害和公共卫生负担已经成为我国亟待解决的健康问题。本研究以酒精性脂肪肝患者为研究对象，观察肥胖和糖耐量异常对其氧化应激状态与凋亡通路的影响，探讨肥胖和糖耐量异常协同促进酒精性脂肪肝发展的机制。
结果
表明肥胖与乙醇协同作用，通过胰岛素抵抗激活氧化应激通路调控Caspase 3促进细胞凋亡，从而加重酒精性肝损伤。
肝脏是乙醇代谢的主要脏器，也是酒精性损伤的主要器官。酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)的发病率呈逐年上升趋势，每年因过量饮酒引起的个体健康危害、公共安全危害和公共卫生负担已经成为我国亟待解决的健康问题。临床上依据进展顺序和病情严重程度可将ALD分为轻症ALD、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化5个阶段，约15%的酒精性肝硬化最终发展为肝癌，严重威胁患者生命。
研究表明乙醇造成的肝细胞损伤具有阈值效应，即达到一定饮酒量或饮酒年限后肝损伤风险会大幅增加。ALD的严重程度受种族、性别、体型等影响，饮食营养等因素可能也与乙醇有协同作用；其发病机制复杂，炎症反应、氧化应激、凋亡等多条通路参与其中。然而，目前关于酒精性脂肪肝进展及其危险因素的研究较少。
随着居民生活水平的提高，人群中发病率与ALD同样明显升高的还有肥胖和以糖尿病为代表的代谢性疾病；肥胖与脂肪肝及糖耐量异常密切相关。本研究以酒精性脂肪肝患者为研究对象，观察肥胖和糖耐量异常对其氧化应激状态及凋亡通路的影响，探讨肥胖和糖耐量异常协同促进酒精性脂肪肝发展的机制。
研究是如何开展的？
1．研究对象：
选择2016年1月至2018年6月在承德医学院附属医院消化科就诊的酒精性脂肪肝患者146例，年龄范围为30～69岁。所有纳入患者均符合《酒精性肝病防治指南(2018年更新版)》酒精性脂肪肝诊断标准：①饮酒史≥5年，乙醇摄入量≥40 g/d(男)和≥20 g/d(女)。②临床症状表现为非特异性，无明显症状。③实验室检查示AST、ALT水平均在正常值范围[ALT正常值范围为9～50 U/L(男)、7～40 U/L(女)，AST正常值范围为15～50 U/L(男)、13～35 U/L(女)]。④肝脏超声检查有以下任意2项典型脂肪肝表现：肝区近场回声弥漫性增强，强于肾脏；肝区远场回声逐渐下降；肝内管道结构不能清晰显示。⑤除外肝炎病毒感染、药物性肝病、自身免疫性肝病和中毒性肝病等。乙醇摄入量计算公式：乙醇摄入量(g)＝饮酒量(mL)×含乙醇浓度(%)×乙醇密度。BMI 28.0～32.0 kg/m2为肥胖患者，BMI 18.5～23.9 kg/m2为非肥胖患者。糖耐量减低患者纳入标准：空腹血糖<7.0 mmol/L且糖负荷2 h血糖为7.8～<11.1 mmol/L。根据BMI及糖耐量将146例患者分为4组：肥胖但糖耐量正常组(38例)、肥胖且糖耐量减低组(36例)、非肥胖且糖耐量正常组(36例)、非肥胖但糖耐量减低组(36例)。本研究通过承德医学院附属医院伦理委员会审核批准(LL018)。
2．超声检查：
采用美国GE公司Logiq 9型超声仪或荷兰Philips公司EPIQ5型超声仪进行肝脏超声检查。
3．实验室检查：
采集患者外周静脉血，使用AU5800型全自动生化分析仪(美国贝克曼公司)检测ALT、AST水平。
4．血清胰岛素水平测定：
采用ELISA法(试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司)检测血清胰岛素水平，并计算稳态模型胰岛素抵抗(homeostasis model assessment-insulin resistant，HOMA-IR)指数。HOMA-IR指数＝空腹血糖水平(mmol/L)×空腹胰岛素水平(mU/L)/22.5。
5．口服葡萄糖耐量试验
(oral glucose tolerance test，OGTT)：
分别于患者空腹8 h及口服75 g葡萄糖后30、60、120 min，使用长沙三诺生物传感股份有限公司血糖仪测定患者指尖血糖。
6．氧化应激和抗氧化指标测定：
采用ELISA法检测患者血清脂质过氧化指标丙二醛(malondialdehyde)和活性氧(reactive oxygen species)水平，以及抗氧化指标超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)活性。MDA、SOD、CAT检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，ROS检测试剂盒购自上海逸峰生物科技有限公司。
7．实时荧光定量PCR法：
使用生工生物工程(上海)股份有限公司细胞总RNA提取试剂盒提取血浆总RNA，使用美国Thermo公司超微量紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度。参考文献设计SOD1、SOD2、CAT、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase 3)引物，并使用在线DNA序列数据库GeneBank验证引物序列，引物序列见表1。按照美国贝克曼公司GenomeLab? GeXP试验盒说明书进行反转录获得cDNA，以cDNA为模板、β肌动蛋白为内参照进行PCR。PCR反应条件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min, 34个循环。然后使用GeXP基因分析仪分析各目的基因mRNA的表达量。
研究获得了哪些结果？
1．各组患者饮酒量及BMI：
146例酒精性脂肪肝患者中肥胖但糖耐量正常者38例，其中男29例，女9例，乙醇摄入量分别为(47.01±5.86)、(30.13±6.11) g/d；肥胖且糖耐量减低者36例，其中男28例，女8例，乙醇摄入量分别为(45.40±7.21)、(31.40±4.36) g/d；非肥胖且糖耐量正常者36例，男30例，女6例，乙醇摄入量分别为(46.91±6.76)、(30.93±5.62) g/d；非肥胖但糖耐量减低者36例，其中男28例，女8例，乙醇摄入量分别为(45.12±6.38)、(32.60±4.05) g/d。各组之间同性别患者乙醇摄入量差异均无统计学意义(P均>0.05)。
肥胖但糖耐量正常组和肥胖且糖耐量减低组患者的BMI分别为(30.18±6.22)、(30.27±7.07) kg/m2，两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；非肥胖且糖耐量正常组和非肥胖但糖耐量减低组患者的BMI分别为(23.42±5.83)、(22.42±4.72) kg/m2，差异无统计学意义(P>0.05)。
2．肝脏超声检查结果：
见表2，各组患者肝脏超声检查示，肥胖但糖耐量正常组和非肥胖但糖耐量减低组均以中度脂肪肝为主，肥胖且糖耐量减低组以重度及中重度脂肪肝为主，非肥胖且糖耐量正常组以轻度脂肪肝为主。
3．实验室检查结果：
见表2，肥胖但糖耐量正常组、肥胖且糖耐量减低组、非肥胖且糖耐量正常组、非肥胖但糖耐量减低组患者的ALT和AST表达均在正常值范围。另外，各组患者AST/ALT比值均>2，均符合酒精性脂肪肝的诊断。
4．血清胰岛素水平和HOMA-IR指数：
4组之间血清胰岛素水平与HOMA-IR指数差异均有统计学意义(F＝187.3、244.0，P均<0.01)，其中肥胖且糖耐量减低组患者血清胰岛素水平和HOMA-IR指数最高，分别为(2.32±0.20)μg/L和12.66±0.71，与肥胖但糖耐量正常组[(1.73±0.21)μg/L和8.03±0.67]、非肥胖且糖耐量正常组[(1.25±0.91)μg/L和6.17±0.54]、非肥胖但糖耐量减低组[(2.02±0.20)μg/L和9.57±1.05]相比差异均有统计学意义(血清胰岛素水平t＝16.83、37.62、8.98，HOMA-IR指数t＝6.41、69.56、18.43；P均<0.01)。血清胰岛素水平和HOMA-IR指数在非肥胖且糖耐量正常组与肥胖但糖耐量正常组、非肥胖且糖耐量正常组与非肥胖但糖耐量减低组、肥胖但糖耐量正常组与非肥胖但糖耐量减低组之间差异均有统计学意义(血清胰岛素水平t＝19.39、27.99、7.90，HOMA-IR指数t＝19.32、20.63、4.84；P均<0.05)。
5．OGTT结果：
见图1，4组患者在口服75 g葡萄糖前，即0 min时血糖水平差异无统计学意义(P>0.05)，从口服75 g葡萄糖后30 min开始4组之间血糖水平开始出现差异。计算OGTT UCA显示，非肥胖且糖耐量正常组OGTT UCA值最低，为(14.27±1.60) mmol/L，与肥胖但糖耐量正常组[(15.90±1.06)] mmol/L、肥胖且糖耐量减低组[(17.71±1.51)] mmol/L、非肥胖但糖耐量减低组[(16.44±1.62)] mmol/L相比差异均有统计学意义(t＝5.19、9.52、5.88，P均<0.01)，但在肥胖但糖耐量正常组、肥胖且糖耐量减低组、非肥胖但糖耐量减低组3组之间差异无统计学意义(P＝0.56)。
6．外周血氧化应激和抗氧化能力：
见表3，非肥胖且糖耐量正常组外周血氧化应激指标活性氧和丙二醛水平最低，与肥胖但糖耐量正常组、肥胖且糖耐量减低组、非肥胖但糖耐量减低组比较差异均有统计学意义(活性氧t＝17.02、25.35、16.46，丙二醛t＝46.02、29.07、20.29；P均<0.01)；肥胖且糖耐量减低组活性氧水平也高于非肥胖但糖耐量减低组，丙二醛水平也高于肥胖但糖耐量正常组、非肥胖但糖耐量减低组，差异均有统计学意义(t＝17.04、6.99、17.82，P均<0.01)；肥胖但糖耐量正常组活性氧和丙二醛水平也均高于非肥胖但糖耐量减低组，差异均有统计学意义(t＝8.61、18.96，P均<0.05)。
见表3，非肥胖且糖耐量正常组抗氧化指标SOD活性高于肥胖但糖耐量正常组、肥胖且糖耐量减低组，差异均有统计学意义(t＝14.10、14.22，P均<0.01)；其他各组之间SOD活性差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3，肥胖且糖耐量减低组CAT活性最低，与肥胖但糖耐量正常组、非肥胖且糖耐量正常组、非肥胖但糖耐量减低组比较差异均有统计学意义(t＝7.85、12.12、23.32，P均<0.01)；非肥胖且糖耐量正常组CAT活性与肥胖但糖耐量正常组、非肥胖但糖耐量减低组比较差异亦均有统计学意义(t＝17.36、12.12，P均<0.01)。
7．氧化应激通路相关基因mRNA表达水平：
见图2，肥胖且糖耐量减低组SOD1、SOD2和CAT mRNA表达水平最低(分别为1.67±0.31、 2.95±0.32、 1.06±0.38)，PARP和Caspase 3 mRNA表达水平最高(分别为8.04±0.62、7.73±0.17)，与肥胖但糖耐量正常组(分别为3.22±0.16、4.78±0.45、3.21±0.42、6.34±0.57、5.78±0.16)、非肥胖且糖耐量正常组(分别为5.64±0.24、6.02±0.21、4.78±0.32、3.56±0.49、3.37±0.56)、非肥胖但糖耐量减低组(分别为4.32±0.11、5.33±0.36、3.98±0.21、4.32±0.33、4.21±0.25)相比差异均有统计学意义(t＝27.24、20.06、23.05、12.29、50.83，60.76、48.13、44.93、34.01、44.70，48.34、29.65、40.35、31.78、69.86；P均<0.01)；SOD1、SOD2、CAT、PARP和Caspase 3 mRNA表达水平在肥胖但糖耐量正常组与非肥胖且糖耐量正常组、肥胖但糖耐量正常组与非肥胖但糖耐量减低组之间差异均有统计学意义(t＝51.29、15.05、18.01、22.44、25.46，t＝34.28、5.79、9.89、18.52、32.35；P均<0.01)；SOD1、SOD2、CAT和Caspase 3 mRNA表达水平在非肥胖且糖耐量正常组与非肥胖但糖耐量减低组之间差异亦均有统计学意义(t＝30.00、9.93、12.54、8.22，P均<0.01)，而PARP mRNA表达水平在非肥胖且糖耐量正常组与非肥胖但糖耐量减低组之间差异无统计学意义(P>0.05)。
图2 各组酒精性脂肪肝患者不同基因mRNA表达水平
注：SOD为过氧化物歧化酶；CAT为过氧化氢酶；PARP为多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶；Caspase 3为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3。a与肥胖但糖耐量正常组比较，P<0.05; b与肥胖且糖耐量减低组比较，P<0.05; c与非肥胖且糖耐量正常组比较，P<0.05
研究结果有哪些提示？
酒精性肝损伤是过量饮酒引起的肝脏相关性疾病，其发生、发展与营养、遗传等多种因素密切相关。酒精性脂肪肝是酒精性肝损伤的最初阶段，也是最常见的一种损伤类型，病理表现为肝细胞内大量脂质沉积并伴炎症细胞浸润和肝细胞损伤，这一阶段为可逆阶段，经适当的干预和治疗后可逆转。如果继续进展将导致肝细胞的广泛坏死与不规则再生，从而发展为肝硬化，但该阶段目前尚无有效的治疗方法。因此对酒精性脂肪肝发病机制的深入研究可能为早期治疗ALD提供理论支持和治疗靶点。
胰岛素通过与特异性受体结合激活体内多条信号通路，从而维持体内糖代谢稳定；文献报道胰岛素具有调节氧化还原平衡的作用，通过激活人核因子红细胞2相关因子2增强抗氧化系统，还可在整体水平活化抗氧化剂复合链或网络。胰岛素抵抗是指机体受胰岛素调控的组织或细胞对胰岛素敏感性下降的状态。随着生活水平的提高，人们生活方式和饮食结构的变化使肥胖患者越来越多，肥胖易导致代谢综合征和2型糖尿病等多种代谢性疾病，这些疾病的典型表现就是胰岛素抵抗。本研究根据患者BMI将酒精性脂肪肝患者分为两大类，一类为肥胖患者，一类为非肥胖患者，检测发现酒精性脂肪肝伴肥胖患者的血清胰岛素水平和HOMA-IR指数较高，即胰岛素敏感性降低，而酒精性脂肪肝非肥胖患者胰岛素敏感性增强。
近年来脂肪肝的"二次打击"学说被广泛关注，即乙醇造成的肝脂肪变性是"第一次打击"，而内毒素、细胞因子和氧化应激产物成为"第二次打击"的主要来源。氧化应激水平取决于氧自由基与抗氧化的平衡，如果氧自由基过多或抗氧化能力下降将会破坏这一平衡，导致氧化应激，从而促进细胞的损伤。评价氧化应激的指标较多，其中活性氧、丙二醛可以特异性地反映体内氧自由基和脂质过氧化水平。本研究检测不同组患者的活性氧、丙二醛、SOD和CAT水平，发现乙醇、肥胖、糖耐量异常3个因素共同存在的患者氧化应激水平最高，即活性氧和丙二醛水平最高；而仅有乙醇单一因素的患者，即酒精性脂肪肝不伴肥胖糖耐量正常患者的活性氧和丙二醛水平最低；当在乙醇这一因素基础上增加肥胖或增加糖耐量异常因素时，活性氧和丙二醛水平均升高；另外，本研究发现肥胖比糖耐量异常更易激活氧化应激。检测抗氧化指标SOD和CAT活性发现，酒精性脂肪肝伴肥胖且糖耐量异常患者的抗氧化能力最低，酒精性脂肪肝伴肥胖但糖耐量正常患者的CAT和SOD活性较高。mRNA水平检测结果与上述检测结果一致。
凋亡是受基因调控的程序性细胞死亡，酒精性肝损伤中肝细胞凋亡可以反映肝损伤程度。Caspase 3因其是凋亡过程中重要的执行分子，其活性程度代表着细胞的凋亡状态。检测PARP和Caspase 3 mRNA水平显示，酒精性脂肪肝伴肥胖且糖耐量异常患者表达水平最高，而不伴肥胖且糖耐量正常的患者表达水平最低，这一检测结果与患者的基础资料相符合。
本研究探讨了肥胖在酒精性肝损伤中的作用机制，证实了肥胖与乙醇2个因素协同作用导致胰岛素抵抗增强，降低了机体抗氧化能力；同时，存在肥胖因素条件下，乙醇导致机体氧化应激增强。乙醇与肥胖协同作用，通过胰岛素抵抗激活氧化应激通路调控Caspase 3促进细胞凋亡，从而加重酒精性脂肪肝，促进酒精性肝损伤进展。但是，肥胖引起的胰岛素抵抗是否为促进ALD唯一或主要的方式，还需要进一步通过建立动物模型深入研究。
参考文献：略
文章来源：中华消化杂志,2019,39( 7 )
作者：何培元 、侯志平 、王磊 、王鑫 、李萍 、张肖丽 、李炳庆
转自：消化科空间
