大连Gut：人体肠道微生物组——希望，威胁和承

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希望、承诺和威胁：对概念证明不可或缺的需求

评论的最后部分致力于讨论关键问题以及在声称某些微生物有益或有害之前开展明确实验的必要性。如上所述，当发现某种微生物与疾病或健康状况之间存在相关性时，明确该微生物对疾病发作的促进或改善作用仍具有挑战性。

换句话说，正如前面段落中所提到的，文献经常讨论特定候选细菌对某些作用的潜在有益或有害影响。然而，有时我们可能会在没有对这些影响进行深入研究的情况下太快推断出正面或负面作用。

因此，我们研究人员通常从相关性开始，很少通过使用分离的细菌或鉴定的代谢物来证明某些概念。这不是因为我们不想调查“新”微生物或代谢物的作用，而是某些细菌可能很难进行培养。实际上，从16S水平鉴定到候选细菌的适当分离到复杂模型（甚至体外）的研究通常需要很多时间和精力。尽管文化组学方面最近取得了进展，但厌氧细菌的分离和鉴定仍然耗时且困难重重。此外，分离和培养某候选细菌仍然需要以与慢性体内试验类似的环境去培养它。

最重要的是，以目前我们的知识水平，完全破译某一微生物在肠道微生物群等复杂群体中的作用仍然非常困难。最后一点我们通过两个具体实例来予以说明：普氏菌（Prevotella copri）和嗜粘蛋白-艾克曼菌（Akkermansia muciniphila）。

普氏菌在代谢疾病中的案例

最近两项独立的试验研究了普氏菌的作用。两篇开创性论文都是从人体观察研究中获得数据从而得出结论，随后在小鼠干预研究中得到证实。但两项研究却说明了一个简单的关联研究是如何误导结果，以及潜在因素如何影响功能性概念验证研究的差异甚至相对结果的。

第一个试验发现，普氏菌可通过与膳食纤维发酵产生琥珀酸相关的机制改善葡萄糖代谢和胰岛素敏感性。更准确地说，De Vadder等人发现富含可发酵膳食纤维的饮食与琥珀酸盐的产量增加有关。他们发现在接受膳食纤维的小鼠中，琥珀酸盐的丰度在盲肠含量较高，而门静脉中则不然。因此，他们假设琥珀酸被肠细胞用作底物。琥珀酸盐是肠道糖异生（一种改善葡萄糖体内平衡的过程）的底物。更重要的是，他们证明琥珀酸喂养可以改善葡萄糖耐受及胰岛素敏感性。类似地，用普氏菌定植小鼠复制了这种在高脂肪/高蔗糖喂养的小鼠中的获益模型。最后，通过使用具有肠上皮细胞特异性缺失参与糖原异生的限速酶（即葡萄糖-6-磷酸酶）的小鼠模型，他们证明了普氏菌产生的琥珀酸是改善葡萄糖和胰岛素敏感性的一种必需的机制。

在第二项研究中，Pedersen等人发现胰岛素抵抗个体的代谢组存在高水平的支链氨基酸（BCAAs），其与富含这种BCAA的生物合成途径的微生物组相关。在与该观察结果相关的细菌中，鉴定出了普氏菌和普通拟杆菌。为了实验证明普氏菌与葡萄糖代谢改变之间的关系，他们用普氏菌或载体灌胃高脂肪喂养的小鼠。研究者发现给予普氏菌会加重葡萄糖耐受不良、胰岛素敏感性降低且血清总BCAAs水平增加。

总之，尽管两项研究都是作为概念验证研究进行设计和实施的，但是普氏菌是否应被视为有益或有害菌，可能取决于个体饮食环境并需要进一步证实。

最近的另一个关键例子是细菌嗜粘蛋白-艾克曼菌，引起人们很大的兴趣。这种细菌是人类肠道微生物群中最丰富的单一物种之一（在基础条件下高达总细菌的5％），并且在2004年由Willem de Vos教授分离并被鉴定有利用粘蛋白的特性。今天，嗜粘蛋白-艾克曼菌被几位科学家视为下一代的有益微生物。

艾克曼菌在心血管代谢疾病中的案例

据描述，嗜粘蛋白-艾克曼菌在遗传性或饮食诱导的肥胖和糖尿病小鼠的肠道微生物群中的含量较少。有趣的是，在这些小鼠中，系统性地发现嗜粘蛋白-艾克曼菌的丰度与体重、脂肪量、炎症、胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良呈负相关（图3）。该观察结果表明该细菌可能是有意义的。有少量研究报道了小鼠摄入高脂肪高蔗糖饮食时嗜粘蛋白-艾克曼菌的丰度增加。而相反的结论则被广泛证明，益生元喂养（例如，用菊粉型果聚糖和一些多酚）显著增加了嗜粘蛋白-艾克曼菌并改善了与肥胖相关的代谢紊乱，包括减少脂肪量和胰岛素抵抗、降低肝脏脂肪变性和加强肠道屏障。重要的是，在人类的几种病理状况下，例如肥胖、2型糖尿病、高血压、高胆固醇血症和肝病，人们观察嗜粘蛋白-艾克曼菌的丰度下降（图3）。二甲双胍（是最广泛使用的抗糖尿病治疗）和减重手术，显著增加了嗜粘蛋白-艾克曼菌的丰度（高达总微生物群的20％）。

▲ 图3 | 嗜粘蛋白-艾克曼菌与几种疾病之间的关系：已知的是什么？主要的混杂因素是什么？

该图片说明了不同的病理情况下发现细菌嗜粘蛋白-艾克曼菌的丰度增加或减少。它还突出了与肠道微生物群的调节相关的几个混杂因素，并最终根据健康状况显示了嗜粘蛋白-艾克曼菌的丰度，并显示了当前已经进行了疾病与细菌存在之间的联系的概念验证的数据。

除了这些充足的相关数据之外，在过去的两年中，一些论文采用了概念验证策略调查了体内和不同模型中施用嗜粘蛋白-艾克曼菌的影响。现在已经接受了补充嗜粘蛋白-艾克曼菌可以防止几种心血管代谢特征。用嗜粘蛋白-艾克曼菌处理动物的所有研究表明，细菌降低了体重和脂肪量的增加、肝脂肪变性、炎症、胆固醇水平和动脉粥样硬化；通过影响不同因素（即黏液层厚度、紧密连接蛋白、抗菌肽和免疫力）来改善胰岛素敏感性并恢复肠道屏障功能（图3）。值得注意的是，嗜粘蛋白-艾克曼菌作用的潜在关键机制之一是通过特定化合物，例如蛋白质'Amuc_1100'。最近在这种细菌的外膜上发现了这种蛋白质，这种蛋白质在体内和体外都具有免疫调节作用，而且嗜粘蛋白-艾克曼菌对免疫系统的这种作用非常重要，因为最近已经显示出嗜粘蛋白-艾克曼菌延迟糖尿病易感动物的1型糖尿病的发病。

艾克曼菌和基于免疫的癌症治疗：概念证明

关于免疫性，无论是在代谢综合征的背景下，还是用于减少如上所述的自身免疫性1型糖尿病，或是在癌症治疗的背景下，艾克曼菌的影响似乎都是非常重要的。先前已经表明，抗癌疗法可能依赖于肠道微生物群的组成。而在最近的一系列研究中也发现了嗜粘蛋白-艾克曼菌在这方面的作用。具体而言，作者已经表明肠道微生物群甚至特定的关键细菌物种可能影响抗癌免疫疗法的结果，例如抗PD-1治疗。首先，作者简单地观察到，与无应答者相比，对抗PD-1治疗有反应的患者肠道嗜粘蛋白-艾克曼菌丰度增加。该观察结果表明，在嗜粘蛋白-艾克曼菌存在下可观察到有利的药物反应。虽然这一发现仅是一个简单的相关性，但当他们决定将应答者和非应答者的微生物群转移到小鼠体内时，作者显然转向了概念验证策略。在该实验中，作者观察到类似的反应，即在没有嗜粘蛋白-艾克曼菌的情况下药物反应改变。他们使用了特定的模型，即无菌或抗生素治疗的小鼠，在这些小鼠中定植来自应答者或非应答者供体的微生物群，用细菌嗜粘蛋白-艾克曼菌治疗可逆转接受来自非应答者的微生物群小鼠的抗PD-1阻断的功效。因此，应答不良的小鼠（即用非反应性粪便物质定殖）在用嗜粘蛋白-艾克曼菌治疗时变成了应答者，这一结果清楚地表明了这种细菌的存在起到了重要作用。更重要的是，作者发现这一结果是嗜粘蛋白-艾克曼菌免疫调节作用的结果。尽管有这个非常重要的发现，但我们不能排除这种效应不是直接由这种细菌介导的，而是需要与一种或几种其他关键种类进行活动（或交叉作用），从而产生有益效果。此外，需要进一步的人体研究以将细菌视为本文中提到的治疗佐剂。

艾克曼菌在神经退行性疾病中的案例

虽然上面已经描述了不同的概念验证研究，但是存在其他即粪便中的嗜粘蛋白-艾克曼菌的过度表达与有益效果无关的情况。最近公布了一系列研究帕金森病和多发性硬化症（MS）的研究结果。

最近发表的论文描述了MS患者的肠道微生物组并且鉴定了特定微生物的变化。在患者和对照组之间，有25种不同细菌的水平存在显著差异，其中一种细菌是嗜粘蛋白-艾克曼菌。引人注目的是，Berer等人和Cekanaviciute等人的研究将他们的注意力集中在了MS患者粪便中的嗜粘蛋白-艾克曼菌丰度的增加上。然而，虽然两项研究都简洁地证明了，与对照个体相比，受MS影响的个体的粪便微生物群移植到MS的小鼠模型后疾病进展恶化，但这些研究将人类供体的微生物群移植到受体小鼠后没有一个能够检测到艾克曼菌的存在或丰度的任何变化。因此，该观察结果在研究的这个阶段排除了嗜粘蛋白-艾克曼菌在疾病发作中的作用。    

该发现还表明，人类而非啮齿动物粪便样品中存在嗜粘蛋白-艾克曼菌，通过用相同的人类粪便定殖而发生该疾病可能是由于其他细菌候选物。沿着这个逻辑，这些论文中很少有人将神经退行性疾病患者的经典药物治疗的潜在影响解析为可以诱导明显特征的重要混杂因素，如之前在此类疾病中所示的（图3）。

实际上，可以与几年前发表的一些开创性研究进行类似的比较，其显示了2型糖尿病和非糖尿病患者的肠道微生物群组成的差异，包括了嗜粘蛋白-艾克曼菌的增加。几年后，终于发现之前的结果（至少在这种细菌上）是由于药物治疗（即二甲双胍、利拉鲁肽）而实际上存在缺陷（图3）。在使用强烈影响肠道微生物群的质子泵抑制剂时进行了类似的观察。

因此，有人可能会争辩说，我们应该在所有未来的研究中考虑这种混杂因素，包括神经退行性疾病。

实际上，在这些疾病中，绝大多数的患者都会发生饮食习惯变化、慢性便秘和其他胃肠道合并症；因此，这些病理通常与肠道运动性和其他前运动区症状的变化相关。有趣的是，已经充分描述了排便频率和一致性（图3）是肠道嗜粘蛋白-艾克曼菌丰度的主要因素。事实上，最近的一篇论文强调了评估微生物组研究中排便频率和一致性的重要性。此外，热量限制和禁食期是神经退行性疾病患者的摄食行为的关键特征，并且这些因素已被证明可以增加人体肠道中的嗜粘蛋白-艾克曼菌的丰度。

这些不同的例子强烈地向我们表明，在主张一些微生物的风险或有益效果之前，我们需要仔细分析和证明因果关系。如上所述，过去十年的特点是有大量论文评估健康或患病群组的微生物组之间的差异。因此，文献中几乎每天都会看到数据的错误解释和声称细菌基于丰度变化参与的表型（图3）。

最后，除了普氏菌和嗜粘蛋白-艾克曼菌的情况之外，最近结合了观察和概念验证研究的数据也表明，特定物种可能直接参与保护免于与肥胖相关的代谢紊乱（例如小克里斯滕森氏菌）或者相反，可能有助于这种代谢紊乱（例如皮氏罗尔斯顿菌，阴沟肠杆菌）的发生。因此，这些类型的研究结果很有意思，但如前所述不能一概而论，需要广泛的研究进一步确认。

结论和展望

我们的肠道中含有大量的微生物，包括细菌、古细菌、病毒和真菌。毫无疑问，我们在分析微生物群的组成和产生的关键代谢物，甚至在发现和分离新细菌方面取得了进展。然而，我们必须承认，过去几年发表的大量研究报告了不同条件下微生物组的差异。虽然它们中的大多数表现非常好，但我们仍然需要更多的工作来明确关联性以外的作用，如果我们想要接近最终的因果关系，需要提供尽可能多的复杂分析（例如，多元组和时间序列测量）。实际上，简单的关联性研究结果可能导致在转化为人体背景时对预期结果的误解或过度吹嘘。因此，比较疾病和健康状况，然后将因果关系进行概念证明，这两种方法都很重要。一般人群以及健康从业者在从论文中得出假设肠道微生物群组成的差异可能与特定疾病或其整体进化密切相关的结论时应该严谨。

参考文献：Cani PD. Human gut microbiome: hopes, threats and promises. Gut 2018;67:1716–1725.

作者： 消化客

来源： 江苏省人民医院消化科

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