肿瘤微环境是由肿瘤细胞、多种肿瘤间质细胞、细胞外基质及其内多种可溶性生物因子等共同构成的复杂微环境^[6]。它既可以诱导肿瘤细胞基因突变促进肿瘤的增殖、侵袭、转移，也可诱导产生多种生物因子及形成肿瘤间质屏障造成肿瘤的耐药。肿瘤微环境在GEP-NET的发生发展和药物的治疗调控中有重要作用，从肿瘤微环境中发现新的治疗靶点、开创新的治疗方向，是未来改善GEP-NET治疗效果的重要策略^[7]。

神经内分泌肿瘤具有肿瘤内大量新生血管形成的特点，常表现为富血运病变。大量的新生血管为肿瘤提供必需的营养、促进肿瘤生长，同时通过血液途径可向远处播散肿瘤细胞，形成转移性病灶。神经内分泌肿瘤内血管的大量生成由肿瘤微环境内多种血管生成促进和抑制因子共同作用所致^[8]。

VEGF是作用最强的促血管生长刺激因子，可通过作用于血管内皮细胞上特异性酪氨酸激酶受体——血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）1、2刺激血管内皮细胞增殖，促进血管生成。

与正常组织的对比研究结果显示，在正常组织中VEGF的表达和分泌多局限于胰腺内分泌细胞，如G细胞和PP细胞，但在GEP-NET组织中，VEGF和VEGFR均呈过度表达。有学者通过免疫组化检查发现，50%~80%的胰腺神经内分泌肿瘤的VEGF阳性，同时伴有肿瘤细胞间VEGF强阳性表达，以及肿瘤细胞间和血管内皮细胞中VEGFR-1、2呈阳性表达。

VEGF可使肿瘤内血管通透性增强，促进神经内分泌肿瘤细胞发生侵袭与转移，其介导产生的肿瘤新生血管的管壁常为单层内皮细胞，伴有平滑肌、基底膜薄弱或缺如，有利于肿瘤细胞的穿透。有研究结果显示，转移性神经内分泌肿瘤患者血浆中VEGF浓度高于无远处转移患者；体外小鼠动物模型实验结果亦显示，VEGF表达上调对胰腺神经内分泌肿瘤发展、转移起到重要作用^[9,10]。

神经内分泌肿瘤富血运环境的形成还有其他细胞因子的参与，促血管生成素（angiopoietin，Ang）2即其中重要的一种。Ang家族与新生血管形成密切相关，以Ang-1和Ang-2与血管生成关系最密切。Ang-2可与内皮特异性受体酪氨酸激酶2（tyrosine kinase 2，TIE-2）结合，在血管生成过程中充当Ang-1-TIE2信号的负性调控因子，也可作为血管生成的启动子。在胰腺神经内分泌肿瘤组织中可观察到Ang-2的表达明显增多，且其表达多位于肿瘤细胞中，而肿瘤周围间质则未见明显表达，说明Ang-2可能具有调节肿瘤新生血管生成的作用，进而调节肿瘤发生与进展^[11,12]。

除上述外，其他可能参与血管生成的因子，如内皮抑素，是一种内源性抑制血管内皮细胞增殖及迁移的多肽类物质，亦是目前发现的最强的血管生成抑制剂，但在GEP-NET临床试验中，应用其重组类似物治疗未见肿瘤明显消退^[13]。

血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）在约70%的人GEP-NET及相应转移病灶的肿瘤间质细胞中大量表达。研究发现，PDGF的表达分泌程度与肿瘤的毛细血管密度呈相关性，这说明PDGF可能也存在调节促血管生成的作用。

胎盘生长因子（placenta growth factor，PLGF）是一种肝素结合酸性蛋白，属于VEGF家族，可通过结合VEGFR1、NRP-1、NRP-2等受体促进病理性肿瘤血管生成^[14]。Hilfenhaus等^[15]的研究发现，对比健康人血浆，小肠或胰腺神经内分泌肿瘤细胞患者的循环血浆中PLGF浓度明显升高，同时发现PLGF在人胰腺神经内分泌肿瘤间质中大量表达，而在肿瘤细胞内及正常胰腺组织中未检出，说明PLGF可能通过参与肿瘤间质内血管生长因子相互作用调节肿瘤新生血管形成，参与肿瘤的进展。

神经内分泌肿瘤具有大量新生血管形成、肿瘤血运丰富的特点，抗血管生成可作为GEP-NET的治疗靶点，抗血管治疗药物包括血管内皮生长因子抑制剂（贝伐珠单抗）、受体抑制剂类药物（苹果酸舒尼替尼，拮抗VEGFR-1、2和kit）、靶向药物（依维莫司，靶向mTOR通路抑制剂）、SSAs（抑制肿瘤细胞分泌VEGF）。

血管内皮生长因子抑制剂可以消除肿瘤内促血管生成因子，抑制血管内皮细胞生成和转移，减少肿瘤内新生血管的产生。贝伐珠单抗是一种单克隆IgG抗体，通过与VEGF-A结合，抑制VEGFR-1、2的激活，使肿瘤血管快速退缩、肿瘤内异常血管结构正常化，降低肿瘤内压力，抑制肿瘤内血管生成，进而抑制肿瘤生长。II期临床试验中，贝伐珠单抗治疗临床不可切除的转移性类癌的疾病缓解率较好，但在III期临床试验中，未见患者的生存期延长^[16,17]。

苹果酸舒尼替尼是目前神经内分泌肿瘤中最有代表性的受体抑制剂类药物。舒尼替尼是多种酪氨酸激酶抑制剂，可抑制VEGFR、集落刺激因子1受体、PDGF受体β、PDGF受体α、干细胞因子受体等多种促血管生成因子结合受体。Raymond等^[18]和Nasir等^[8]的临床研究发现，该药可提高晚期胰腺神经内分泌肿瘤患者的无进展生存期和客观缓解率。但动物实验研究发现，阻断VEGFR可能导致肿瘤内缺氧，同时引起其他促血管生存因子的产生，如缺氧诱导因子、成纤维细胞生长因子，进而导致抗血管药物耐药、肿瘤血管重新生成。

PI3K-AKT-mTOR信号转导通路具有促进物质代谢、参与细胞凋亡、自噬、在多种疾病中扮演着不可忽视的角色，在神经内分泌肿瘤中，PI3K-AKT-mTOR信号转导通路的激活可以抑制细胞凋亡，加快细胞周期进展，进而促进肿瘤细胞生长、增殖、侵袭和转移，同时亦参与肿瘤内新生血管形成。在对胃癌和结直肠癌动物模型的研究中发现，mTOR抑制剂能降低肿瘤微环境内微血管的密度^[19]。近年来Yao等^[20]在III期临床试验RADIANT-2、RADIANT-3中评估了依维莫司在晚期胰腺神经内分泌肿瘤的治疗疗效及安全性，与安慰剂组相比，实验组应用依维莫司作为靶向治疗可延长患者无进展生存期，同时mTOR抑制剂联合兰瑞肽的内分泌治疗同样取得了相似的结果。

SSAs在神经内分泌肿瘤治疗中亦具有抗肿瘤血管生成的作用。GEP-NET高表达生长抑素受体（somatostatin receptor，SSTR），既往研究者认为，SSAs作用于神经内分泌肿瘤内的SSTR，诱导细胞周期组织，诱导凋亡，抑制肿瘤增殖。Bocci等^[21]研究发现，SSAs可通过结合SSTR-1或SSTR-3抑制肿瘤微环境内血管内皮细胞增殖，进而抑制肿瘤内血管生成。但在Bocci等^[21]和Walter等^[22]的研究未观察到奥曲肽对肿瘤生长及肿瘤内微血管密度变化的影响。目前，SSAs在神经内分泌肿瘤中的抗血管生成作用的相关研究尚待进一步开展，未来需对SSTR各亚型对神经内分泌肿瘤的作用进行深入研究。

尽管前瞻性临床研究结果显示舒尼替尼、贝伐珠单抗在晚期转移性神经内分泌肿瘤抗血管生成治疗上取得了一定成果，但因肿瘤耐药性的原因，很快即可再次恢复血管生成和肿瘤生长^[18,23]。目前研究认为存在两种抗血管生成药物的耐药机制可能为：

①固有性耐药，即肿瘤本身对抗血管生成药物耐药，在GEP-NET中较少见，仅在少数使用舒尼替尼治疗的胰腺神经内分泌肿瘤患者中观察到。临床可表现为抗血管生成药物治疗后肿瘤不仅无明显退缩，且仍有进展，肿瘤增长无明显减缓等表现，其可能的机制为肿瘤微环境内可产生大量其他的非VEGF的促肿瘤血管生成因子，可克服VEGF信号通路的抑制，维持肿瘤内血管持续生成。

②获得性耐药，也称为继发性耐药，为肿瘤在药物治疗过程中逐渐出现的药物适应，从而产生的耐药性。在GEP-NET中，继发性耐药的形成可能是由于抗血管药物治疗后，原肿瘤血管生成通路的信号靶点受抑制，其他替代性血管生成信号通路激活所致。在抗血管生成治疗后，肿瘤内缺氧环境的形成，促进肿瘤细胞释放大量缺氧诱导因子低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α），HIF-1α可调节下游基因表达，诱导多种促血管生成因子的合成维持肿瘤血管生成，同时增强肿瘤细胞对低氧耐受，是继发性耐药形成的常见机制^[24]。因此，未来仍需对神经内分泌肿瘤抗血管生成药物耐药机制相关通路进行深入研究，进而探索新的更有效的药物。

肿瘤微环境中的间质成分、生长因子及细胞因子是肿瘤微环境的重要组成部分。这些生长因子和细胞因子可促进肿瘤细胞生长、侵袭、转移，同时具有调节肿瘤对化疗及靶向治疗敏感性的作用。

1. PDGF

PDGF是由血小板、巨噬细胞、血管内皮细胞、上皮细胞等多种细胞释放的常见的生长因子，生理过程可促进机体生长、损伤修复，但在肿瘤组织中可促进肿瘤细胞增殖、迁移，刺激肿瘤血管及淋巴管生成，加快肿瘤进展。它可结合两种特异性酪氨酸蛋白激酶受体PDGFR-α和PDGFR-β，参与肿瘤细胞的增殖分化及侵袭迁移。

在小肠及胰腺神经内分泌肿瘤中可见大量PDGFR-β表达。同时，在神经内分泌肿瘤的转移灶（如肝脏转移或区域淋巴结转移）中可观察到的PDGFR表达量超过原发病灶，提示其与肿瘤转移密切相关^[15]。在神经内分泌肿瘤微环境内，大部分PDGF表达于肿瘤间质细胞，仅少部分表达于肿瘤细胞内^[16]。肿瘤细胞与肿瘤间质间可见到明显的PDGFR表达水平的改变，接近于肿瘤细胞的间质细胞的PDGFR-β表达丰富，远离肿瘤细胞的间质内PDFGR表达相对减少。

目前认为，PDGF主要可通过自分泌或旁分泌方式在肿瘤间质内产生作用，在其他恶性肿瘤研究中发现PDGF可激活多种信号通路，如PDGFR-Ras-MAPK-ERK通路、P13K-Akt通路、Notch-1信号通路、PDGFR-JAK-STAT通路等促进肿瘤细胞增殖、肿瘤内血管生成，抑制肿瘤凋亡，促进肿瘤耐药形成，促进肿瘤生长、进展。但在GEP-NET中，目前无法明确肿瘤分化及增殖与肿瘤间质内PDGF-PDGFR的表达是否相关，因此，PDGF参与肿瘤进展相关机制仍需进一步研究。

2.  转化生长因子（transforming growth factor，TGF）

TGF包括两类多肽类生长因子TGF-α和TGF-β。其中TGF-α作为表皮生长因子家族成员，因其与表皮生长因子类似，也具有与表皮生长因子受体结合的作用。大多数神经内分泌肿瘤表达TGF-α和EGFR，其可能有促进神经内分泌肿瘤生长的作用^[25]。在小肠神经内分泌肿瘤动物模型中，使用奥曲肽可明显减少肿瘤TGF-α的分泌。而在人小肠神经内分泌肿瘤中发现，TGF-α可通过激活生长抑素受体途径抑制肿瘤细胞增殖，对抗其促肿瘤生长能力^[26]。

TGF-β是与TGF-α不同的另一类生长因子，在多种正常组织中表达，对细胞增长、分化、免疫调节具有重要调节作用，是一种具有多功能生物活性的细胞因子，在多种恶性肿瘤中高表达，参与肿瘤微环境内免疫细胞调节及肿瘤细胞增殖、浸润、转移。

人体内TGF-β有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三个亚型，在人GEP-NET内及其周围间质中可见显著的TGF-β表达，但TGF-β受体却仅存在于肿瘤细胞内^[26,27]。

体外实验发现，在PNET细胞株BON-1和QGP-1中，TGF-β1对肿瘤细胞的增殖作用不同，在BON-1中添加TGF-β1会抑制肿瘤细胞增殖，但在QGP-1中未观察到类似效果。另外，KRJ-I细胞株是一种人源性小肠神经内分泌肿瘤细胞株，其中的TGF-β1有促进肿瘤细胞增殖及迁移的作用。目前有学者认为TGF-β1对肿瘤具有双向调节作用，它可抑制原癌基因c-myc的表达，诱导细胞G1期停滞，增加p21和p15的表达，抑制肿瘤早期阶段的细胞生长。TGF-β1又可通过促进肿瘤血管形成、逃逸免疫监视等诱发肿瘤生长、进展。

目前，有限的相关研究主要集中于TGF-β在GEP-NET肿瘤细胞及肿瘤微环境内表达情况，且多为观察性研究。TGF-β对神经内分泌肿瘤调节的具体分子机制尚不明确，TGF-β对神经内分泌肿瘤微环境内肿瘤相关性免疫细胞的调节机制仍不清楚，有待进一步研究。TGF-β1及其相关抑制剂对肿瘤的作用机制的研究可作为未来靶向肿瘤微环境治疗的突破点。

3.  结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）

CTGF属于CNN家族，由349个氨基酸合成，可由成纤维细胞、平滑肌、细胞和内皮细胞合成分泌，可促进成纤维细胞增殖、迁移、黏附和细胞外基质的形成。在神经内分泌肿瘤和其他器官纤维化病变的患者血浆中，可检测到较高的CTGF水平。在人小肠神经内分泌肿瘤中，CTGF呈高度表达，在邻近肿瘤纤维血管间质的肿瘤细胞中可观察到明显的CTGF免疫反应活性，其可能与促进肿瘤细胞增殖及周围间质纤维化相关^[27]。

4.  胰岛素样生长因子（insulin like growth factor，IGF）

IGF系统由IGF-1、IGF-2及其相应的IGF-1受体、IGF-2受体，以及6类胰岛素样生长因子结合蛋白组成。多项研究结果显示，IGF参与肿瘤的发生和发展，在人GEP-NET组织中可观察到IGF及其受体的表达；人胃泌素瘤同时伴有肿瘤内IGF-1和IGF-1R的高表达与肿瘤转移高风险相关，常提示预后不佳^[29,30]。在BON-1细胞株实验中发现，通过自分泌途径，IGF-1可调节CgA的分泌水平及调控肿瘤细胞生长；van Adrichem等^[31]的研究发现，应用多巴胺受体激动剂和SSAs可抑制IGF-2的释放，提示IGF-IGF1R系统与下游多巴胺和生长抑素受体信号通路相互作用。针对IGF1和IGF1受体系统的单克隆抗体已经被纳入GEP-NET患者的临床试验中。

5.  其他

嗜铬粒蛋白A（chromogranin A，CgA）是神经内分泌细胞的特异性标志物，CgA及其片段血管抑制素-1、2在GEP-NET微环境中的功能尚不明确，既往研究结果证实其有促进神经内分泌肿瘤细胞增殖的作用，同时其可通过抑制成纤维细胞在肿瘤微环境中的黏附作用，发挥调控肿瘤微环境的功能^[32,33]。有学者在GEP-NET的动物实验模型中发现，小肠神经内分泌肿瘤中CgA的mRNA及蛋白水平均明显升高，沉默CgA的表达可抑制小肠神经内分泌肿瘤细胞的增殖，同时发现肿瘤细胞的增殖与CgA片段血管抑制素-1呈相关性^[32]。

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是一类依赖于锌离子和钙离子的内肽酶，该家族已分离鉴别出至少26个成员，其能够降解细胞外基质，包括层黏连蛋白、胶原、纤维蛋白等多种成分。MMP通过对细胞外基质的降解和重建，促进肿瘤血管生成，为肿瘤提供必要的营养物质和氧气，同时可促进肿瘤的增殖和转移。对神经内分泌肿瘤Rip-Tag2转基因小鼠模型的研究发现，MMP特别是MMP9的表达，对诱发胰岛细胞癌变及肿瘤内血管生成起到关键作用，在MMP9基因敲除小鼠荷载的胰腺神经内分泌肿瘤模型中，肿瘤具有明显侵袭性，其可能通过激活其他信号通路或造成肿瘤内部低氧等机制促进肿瘤进展^[34]。

肿瘤微环境内包括多种肿瘤间质细胞及免疫细胞，如血管内皮细胞、肿瘤相关成纤维细胞、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤浸润淋巴细胞等，在局部耐药性、免疫逃脱起关键性作用。肿瘤浸润淋巴细胞是肿瘤微环境中调节肿瘤免疫反应的一类淋巴细胞，参与TME的免疫浸润。

GEP-NET微环境中有多种淋巴细胞浸润，如CD3+、CD4+ T细胞，CD3+、CD8+ T细胞等。在小肠的胰腺神经内分泌肿瘤中发现，这类淋巴细胞的浸润常伴调节性T细胞的浸润。调节性T细胞主要发挥抑制免疫系统功能，在生理情况下可限制过度免疫应答，避免正常组织损伤，在肿瘤内抑制抗肿瘤免疫细胞的募集，同时阻止多种免疫细胞包括CTL、Th1、B细胞、NK细胞的抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤免疫，促进肿瘤进展^[35]。在神经内分泌肿瘤转移性病灶TME中常可见到较原发灶更多的淋巴细胞浸润，可能与免疫抑制性细胞聚积相关^[36]。

除淋巴细胞外，肿瘤相关巨噬细胞对肿瘤发生和进展起到了复杂的作用，受肿瘤微环境影响，肿瘤相关巨噬细胞的活化分两类，即经典活化的M1型和选择性活化的M2型巨噬细胞。M1型肿瘤相关巨噬细胞可分泌IL-1β、IL-2、IL-5等因子，具有抗肿瘤作用；M2型肿瘤相关巨噬细胞可由肿瘤内巨噬细胞极化形成，也可由血液中的单核细胞在趋化因子CCL-1或集落刺激因子的作用及IL-4、IL-3诱导活化下被募集到肿瘤组织而形成的，具有诱导免疫抑制、促进肿瘤生长作用。

Pyonteck等^[37]在Rip-Tag2小鼠中发现，胰腺神经内分泌肿瘤病灶的数量与肿瘤相关巨噬细胞的浸润呈显着相关；研究发现，在人胰腺神经内分泌肿瘤组织内，肿瘤相关巨噬细胞浸润程度越高，肿瘤的分级和分期越高，肝转移可能性越大，提示肿瘤相关巨噬细胞的浸润与肿瘤的进展及肿瘤预后存在一定的相关性。在其他恶性肿瘤中，M2型TAMs的大量浸润常常是肿瘤预后的不良因素，但目前针对M1、M2型肿瘤相关巨噬细胞细胞在神经内分泌肿瘤肿瘤微环境内的作用机制研究还较为有限。

肿瘤相关成纤维细胞是肿瘤微环境中重要的组成成分，在肿瘤微环境中数量丰富，它主要由间质中正常成纤维细胞经肿瘤细胞活化形成，亦可通过纤维前体细胞的间质转化、上皮细胞的上皮间质转化和骨髓源性间充质干细胞迁移后分化形成。其可产生分泌多种细胞因子、趋化因子，促进肿瘤内血管内皮细胞和免疫细胞的募集，促进肿瘤增殖，还可以合成MMP以降解细胞外基质，促进肿瘤侵袭。肿瘤微环境内活化的肿瘤相关成纤维细胞对肿瘤的发展起重大作用，因此，未来针对肿瘤相关成纤维细胞的治疗将是肿瘤靶向治疗中的重点项目。

近年来，肿瘤的免疫治疗在肿瘤的综合治疗研究中大放异彩，其中包括免疫检查点抑制剂、嵌合抗原受体T细胞免疫治疗、肿瘤疫苗等，它们在多种实体恶性肿瘤及血液系统恶性肿瘤的治疗研究中表现出理想的疗效，尤以细胞毒性T细胞相关蛋白4（cytotoxic T lymphocyte associated protein 4，CTLA-4）或程序性死亡分子受体1（programmed death 1，PD-1）及程序性死亡分子配体1（programmed death 1 ligand，PD-L1）为靶点的免疫靶点抑制剂治疗成为了强有力的新治疗方案。

PD-1是在接触抗原后的T细胞上表达的细胞受体，其与在抗原呈递细胞上正常表达并且在肿瘤细胞上异常表达的配体PD-L1或PD-L2结合，导致T细胞的免疫效应被阻断，造成肿瘤免疫逃逸。PD-1作为负性免疫调节通路，其表达上调是肿瘤避免被免疫系统消灭的关键性抑制性免疫机制之一。

在其他恶性肿瘤如肺癌、黑色素细胞瘤中发现，PD-1/PD-L1抑制剂可明显改善部分患者的生存期。在人的GEP-NET中，PD-1的表达存在明显异质性，仅部分患者表达PD-L1（0~69%），且PD-L1的表达程度与原发肿瘤的位置无明显联系，但在G3期神经内分泌肿瘤中，PD-L1表达水平明显升高。此外，在部分胰腺神经内分泌肿瘤及小肠神经内分泌肿瘤中，可观察到PD-L2的显著高水平表达。

目前已有多项针对PD-1/PD-L1的神经内分泌肿瘤免疫治疗临床试验正在开展中，如pembrolizumab（ClinicalTrials.gov Identifier：NCT02939651，NCT03290079，NCT03290079，NCT03012620，NCT03043664），avelumab（ClinicalTrials. gov Identifier：NCT034147404，NCT03279379，NCT03352934），未来可结合对现有及其他免疫靶点的深入研究，探索更理想的GEP-NET免疫治疗的药物及免疫治疗联合化疗等更系统、更精准的治疗^[38]。

GEP-NET发生、发展、侵袭是一个极其复杂的过程，目前手术、内分泌治疗、化疗、靶向治疗等多学科联合系统性治疗，极大推动了神经内分泌肿瘤治疗的发展，但对于部分晚期不可切除的肿瘤及分化不良的神经内分泌肿瘤患者，其预后改善并不明显，仅少数患者能够获益。对肿瘤微环境TME的认识使我们打开了对GEP-NET研究及治疗方面的新视角，从单纯性的肿瘤细胞层面拓展到肿瘤间质、间质细胞、细胞因子、肿瘤免疫微环境等多个层面，系统并全面性认识肿瘤的发生发展。但目前的研究多局限于体外动物实验和肿瘤细胞株培养，与人体内神经内分泌肿瘤的微环境仍有一定差异，同时对人GEP-NET肿瘤微环境的研究十分有限。未来可结合肿瘤基因测序技术，更加详细地了解肿瘤微环境内各种成分的组成及组分间相应的联系，进一步探索肿瘤微环境中潜在治疗靶点，进而开发更有效的治疗方式^[39]。

【引用本文】叶辰，原春辉，李刚，等．胃肠胰神经内分泌肿瘤的微环境及其相关治疗问题的研究进展[J]．中华外科杂志，2019，57（11）：866-871．

来源：中华外科杂志