Cell | 张玉霞/杨敏/白凡/龚四堂团队合作揭示儿童结肠炎及IBD致病机制及治疗方法
儿童期发病的结肠炎（colitis）和炎症性肠病（PIBD）的发病率逐年增加[1,2]，该类疾病反复发作、治疗无效率高且费用昂贵。中重度结肠炎发病年龄较PIBD普遍偏低，且发病率大幅高于PIBD，但目前仍不清楚儿童期结肠炎是否是导致PIBD及成人IBD的风险因素。广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心消化科杨敏主任医师发现此类患儿外周血血小板计数异常，应用抗血小板的传统药物双嘧达莫对某些患儿有明显的治疗作用。但PIBD临床表现复杂及致病机制不清严重限制了治疗方法的选择和个性化诊疗的开展。
为此，研究团队利用单细胞测序技术首先分析了对照组和PIBD各亚型间结肠黏膜的免疫与非免疫细胞的组成、转录特征及表达通路富集情况。结合全基因组关联分析(GWAS)，研究团队进一步阐述了中国PIBD的易感基因、受累细胞亚型及可能的致病机制。随后，通过肠道免疫表型分析、体外细胞实验、体内动物实验证实胞内第二信使环状单磷酸腺苷（cAMP）的缺乏会导致肠道免疫微环境紊乱，主要表现为：肠黏膜富集大量的磷酸二酯酶4B（PDE4B）和肿瘤坏死因子α（TNFα）高表达的巨噬细胞；CD39在结肠上皮T淋巴细胞中表达下调；血小板在肠黏膜聚集并释放5-羟色胺（血清素）。在阐明机制的基础上，研究团队证实抗血小板药物双嘧达莫可以增加cAMP浓度，并在临床试验中取得了良好的治疗效果。本研究开拓了利用第二信使激动剂治疗儿童和（或）成人结肠炎、PIBD、成人IBD以及其它胃肠道疾病的新领域，有望为家庭和社会节约大量医疗成本。
2019年11月14日，广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心儿科研究所张玉霞研究员，国家临床重点专科儿科消化团队（杨敏、耿岚岚及龚四堂主任医师）与北京大学白凡研究员团队合作在Cell以长文形式发表了题为“Mucosal profiling of pediatric-onset colitis and IBD reveals common pathogenic and therapeutic pathways”（儿童期发病的结肠炎和IBD的黏膜分布揭示了常见的致病和治疗途径）的研究论文，报道了这一儿童疾病研究领域的重大进展。
研究团队回顾了2016~2019年广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心消化内科招募的306名患儿，并根据临床、生化检验、内镜和组织病理学等评分将患儿分为对照、结肠炎、溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）组。结肠炎分为轻（分级1）、中（分级2）、重度（分级3）三个等级。肠镜检查镜下表现中重度结肠炎及UC和CD患者的血红蛋白(HGB)和白蛋白(ALB)显著降低，而超敏C反应蛋白（hsCRP）和血小板计数则升高（图1A-C）。为了阐述致病机制及研究药物靶点，研究团队对17名患儿（包括对照组及PIBD各亚型）的结肠黏膜进行了单细胞转录组及TCR+BCR分析，并将中国儿童的风险基因与各细胞亚型的转录特征进行了关联（图1D-E）。
图1 队列特征与结肠黏膜单细胞图谱
单细胞测序将肠上皮细胞分为了10个亚群，风险基因富集在不同的细胞亚群上，发挥的功能不尽相同（图2）。比如CASP7可能引起肠上皮（coloncytes）凋亡；DVL1可能通过catenin/WNT通路影响上皮细胞的再生；表达在Goblet细胞上的离子通道PIEZO1可能对周围的力学环境比较敏感（图2D-F）。这些蛋白的失调最终可能促进儿童结肠炎及IBD的发生发展。
图2 PIBD与对照组结肠上皮细胞的组成与功能差异
结肠黏膜成纤维细胞和血管内皮细胞共有8个亚群（图3A）。PIBD的肠黏膜含有大量WNT2B高表达和炎性成纤维细胞，这些细胞富集TNFα、NF-κB和压力应答等通路，其中炎性成纤维细胞只在UC中富集（图3B-D）。PIBD中的成纤维细胞分泌更多的能招募并活化髓系细胞的CCL和CXCL家族趋化因子（图3B）。研究团队还发现疾病组的血管生成以及免疫细胞跨内皮迁移增加（图3E-F）。
图3 PIBD与对照组的成纤维与内皮细胞组成与功能差异
CD68+的髓系细胞在PIBD中，尤其是UC和CD患者中的浸润显著增加（图4A），且高表达IL1β和TNFα的巨噬细胞几乎只存在PIBD中，这类细胞中行使降解胞内cAMP功能的磷酸二酯酶4B（PDE4B）表达升高（图4B-F）。抑制PDE4B可以降低炎症因子的释放[3,4]，研究团队通过体外细胞实验证实靶向PDE4B的临床药物双嘧达莫可以显著抑制TNFα、IL1β和IL6的释放（图4G-I）。
图4 PIBD结肠黏膜富集炎性髓系细胞
结合单细胞测序和免疫细胞表型分析，研究团队描述了不同T亚群的克隆扩增及转化情况（图5A-F）。值得关注的是，细胞表面表达的核酸外切酶CD39在CD8+和Vδ1+T细胞的表达在PIBD各亚型中显著降低（图5G）。CD39受cAMP-PKA-ERK-ATF2/CREB调控[5]，可以降解胞外的ATP和ADP，研究团队证实CD39表达缺失确实会导致肠黏膜ADP浓度增加，从而激活血小板促进5-羟色胺的释放，最终诱导黏膜损伤；也通过体外细胞实验证实了靶向PDE4B的临床药物双嘧达莫可以提高Navie CD8+T细胞的CD39表达（图5H-I），这与单细胞转录组分析及过往报道[5]提示提高cAMP可能促进CD39的表达相符。
图5 PIBD结肠黏膜缺乏CD39+的上皮T淋巴细胞
为了证实第二信使激动剂在治疗PIBD的应用潜力，研究团队利用腹腔注射双嘧达莫的方式对硫酸葡聚糖（DSS）诱导的急性肠炎小鼠进行了治疗，发现双嘧达莫可以显著改善小鼠的体重、结肠长度和结肠的组织病理结构，抑制小鼠结肠黏膜的血小板聚集和TNFα的释放（图6A-D）。对9例患儿（8例结肠炎和1例未定型IBD）开展了双嘧达莫的小样本临床试验，发现患者的血小板计数，结肠镜评分和临床综合评分均有明显改善（图6E）。其可能的机制是双嘧达莫通过cAMP-PKA-ERK-ATF2/CREB途径提高CD39的表达，从而抑制血小板的聚集和活化（图6F-G）；同时，该药可以抑制CD68+髓系细胞及TNFα的释放（图6H），最终缓解临床症状。
图6 双嘧达莫在临床上可以缓解结肠炎
总结
研究团队利用深度免疫分型并结合单细胞转录组测序技术、全基因组关联分析（GWAS）、体外、动物实验和临床测试，揭示了结肠炎和炎症性肠病患儿肠黏膜多个细胞亚型中的cAMP通路被抑制，从而导致级联免疫紊乱并最终促进了PIBD的发生发展（图7）。本文还发现了胞内第二信使激动剂双嘧达莫可以提高cAMP，增加CD39的表达，抑制炎性因子分泌和血小板活化，从而为儿童结肠炎及炎症性肠病的防治开拓了新的领域（图7）。未来，此类药物可能会成为儿童和（或）成人胃肠炎症疾病的另一种临床防治选择，有助于降低医疗成本，促进社会和谐。
图7 本课题的技术路线与致病机制
广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心儿科研究所黄冰博士，北京大学生物医学前沿创新中心的陈章华博士研究生，以及广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心儿科研究所的王俊副研究员，消化科耿岚岚主任医师和数据中心梁会营主任为本文的并列第一作者，张玉霞、杨敏、白凡和龚四堂为本文的共同通讯作者。
合作团队声明本文所述实验，均经过广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心伦理委员会，中国临床试验注册中心，以及广州医科大学动物实验伦理委员会的批准和通过，并严格按照批件所述的要求和流程实施。
原文链接：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)31177-8
专家点评
儿童期发病的结肠炎及儿童炎症性肠病（PIBD）的发病率逐年增加，中重度结肠炎的发病年龄较PIBD低，其发病率大幅高于PIBD，目前仍不清楚儿童期发病的结肠炎是否是导致PIBD以及成人IBD的风险因素。儿童结肠炎和PIBD病情迁延，治疗无效率高且费用昂贵，不仅严重影响儿童的身心健康与生长发育，也给家庭和社会也带来了沉重的经济负担。
该团队从临床提出的科学问题出发，充分利用临床优势，首先回顾了2016~2019年广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心消化内科招募的306名患儿，并根据临床、生化检验、内镜和组织病理学等评分将患儿分为对照、结肠炎（colitis），溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）组。对儿童结肠炎进行分级：轻（分级1）、中（分级2）、重度（分级3）。发现肠镜下的中重度结肠炎及UC和CD患者的血红蛋白(HGB)和白蛋白(ALB)显著降低，而超敏C反应蛋白（hsCRP）和血小板计数则升高。研究团队采集了来自对照、结肠炎，溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）的结肠黏膜进行了单细胞转录组及TCR+BCR测序，分析了结肠黏膜的免疫与非免疫细胞的组成、转录本表达特征及通路富集情况，并在各细胞亚群中分析了与儿童结肠炎、炎症性肠病相关的原因。结合全基因组关联分析(GWAS)，进一步阐述了中国PIBD儿童的易感基因、受累细胞亚型及可能致病机制。通过肠道免疫表型分析、体外细胞实验、体内动物实验证实胞内第二信使环状单磷酸腺苷（cAMP）的缺乏会导致免疫微环境发生紊乱，主要表现为：肠黏膜富集大量的磷酸二酯酶4B（PDE4B）和肿瘤坏死因子α（TNFα）高表达的巨噬细胞；CD39在结肠上皮T淋巴细胞中表达下调；血小板在肠黏膜聚集并释放5-羟色胺（血清素）。小样本的临床研究证实抗血小板药物双嘧达莫可以增加cAMP浓度，在对儿童结肠炎有良好的治疗效果。其可能的机制是双嘧达莫通过cAMP-PKA-ERK-ATF2/CREB途径提高CD39的表达，从而抑制血小板的聚集和活化；同时，该药可以抑制CD68+髓系细胞及TNFα的释放，最终缓解临床症状。
该研究提示第二信使激动剂对儿童结肠炎、UC和CD有治疗效果，有可能为患者家庭和社会节约大量医疗成本，并为未来的药物治疗提供新的研究方向。这是临床医生提出问题，与基础研究者通力合作，研究成果最终应用于临床的范例。
研究团队简介
自左至右：王俊，杨敏，张玉霞，陈章华，黄冰
张玉霞
广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心儿科研究所，博士，珠江学者特聘教授，广州市卫生系统高层次人才，博士研究生导师，于2016年4月从沃尔特伊丽莎*霍尔医学研究所 （Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, WEHI)回国组建儿童免疫研究实验室。博士毕业于中国科学院微生物研究所，中国科学院研究生院大学，曾在剑桥大学，WEHI等著名科研机构长期从事分子免疫和表观遗传等领域的研究工作。目前专注于儿童慢病的遗传免疫发病机制研究，阐述儿童过敏、炎症性肠病、自身免疫等的发病机制，研制靶向治疗药物。主持国家自然科学基金面上和重大培育项目各1项。领导实验室获得国自然青年项目1项，是区域免疫重大集成项目的合作方。留学期间曾多次获得美国和澳大利亚自然科学基金的资助。近年在Cell，Nat Immunol，Sci Transl Med、 Blood、 J. Autoimmunity 等免疫学领域的顶级期刊发表科研论文多篇。
杨敏
广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心消化内科主任医师，儿科学博士，硕士生导师。现任中国医师协会儿科医师分会儿童消化专业委员会主任委员。从事儿内科临床及科研教学工作28年余，擅长儿童消化系统疾病的诊断和治疗，积累了大量疑难、重症患者的诊治经验。目前致力于儿童消化道慢性炎症、食物过敏、肠内营养治疗与黏膜免疫等临床研究。近10年以第一作者或通讯作者在Cell，Nutrients，JPEN，Cytokine，J Ethnopharmacol等学术期刊发表SCI论文10余篇。受理专利1项。
白凡
北京大学生物医学前沿创新中心、生命科学学院研究员，博士生导师，国家”青年千人计划”学者，国家自然科学基金委优秀青年基金获得者。2003年本科毕业于北京大学物理系，2008年获英国牛津大学生物物理博士学位。全职回国之后，白凡实验室致力于将先进的单细胞技术应用于重大医学疾病问题的研究，在癌症转移和异质性研究领域和细菌抗生素耐药研究领域取得多项重大研究成果，已在Science, Nature, Cancer Cell, Molecular Cell, PNAS等著名学术期刊发表论文60余篇。
龚四堂
广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心副院长，博士，主任医师，博士生导师，中国医师协会儿科分会副会长，中华医学会儿科分会常务委员，中华医学会儿科分会消化学组名誉组长，广东省医学会儿科分会主任委员，广州市医学会儿科分会主任委员。主要从事儿童营养、胃肠道、肝脏疾病及病毒感染性疾病相关临床、教学和研究工作。在国内外专业杂志上发表论文180余篇，SCI 60余篇，承担国家和省市基金多项。现任《中华儿科杂志》总编助理、《中国实用儿科杂志》副主编、《临床儿科杂志》常务编委等多本杂志编委。《胃镜在小儿上消化道疾病诊断与治疗中的应用》获2007年度广州市科学技术奖二等奖。
